徐靜，由紫暄，4，張君奇，陳正，吳德光，李鋒，4，宋浩，4

（1 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072； 2 天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心和系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072； 3 天津大學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心合成生物學(xué)研究平臺，天津300072； 4 天津大學(xué)青島海洋工程研究院，山東青島266000； 5 茅臺學(xué)院，貴州仁懷564501）

引 言

能源危機(jī)和環(huán)境污染已經(jīng)成為當(dāng)前社會(huì)兩大焦點(diǎn)問題。 多用途生物電化學(xué)系統(tǒng)(bioelectrochemical systems, BES)作為綠色新能源生產(chǎn)方式實(shí)現(xiàn)了很多應(yīng)用[1?3]，如用于從有機(jī)廢物和生物質(zhì)中獲取生物電能的微生物燃料電池(microbial fuel cell,MFC)[4?5]、生產(chǎn)有價(jià)值化學(xué)品的非平衡電發(fā)酵[6?7]、微生物電解制氫電池[8?9]用于二氧化碳固定以及生物材料生產(chǎn)的微生物電合成[8?9]等。然而，用于生物電化學(xué)催化劑的電能細(xì)胞群體的胞外電子傳遞(extracellular electron transfer,EET)效率低，嚴(yán)重制約了BES 系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用。因此，開發(fā)具有高效EET能力的電能細(xì)胞是解決問題的關(guān)鍵。

電能細(xì)胞在發(fā)揮功能過程中普遍以群體形式出現(xiàn)，通過單個(gè)細(xì)胞分泌的黏附素、多糖和DNA 等聚合物在細(xì)胞間相互交聯(lián)形成導(dǎo)電細(xì)胞群體，即電活性生物膜[10?12]。在自然條件下的電活性生物膜往往表現(xiàn)出厚度薄、生物量少以及結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致胞外電子傳遞效率低下。因此，合理地改造電能細(xì)胞，增強(qiáng)電活性生物膜的導(dǎo)電能力是提高胞外電子傳遞的重要方法之一。

本文圍繞利用合成生物學(xué)策略對產(chǎn)電菌進(jìn)行工程改造以形成高效電活性生物膜這一目標(biāo)，系統(tǒng)綜述了近五年國際上最新研究成果。并通過解析多種基因?qū)ι锬ば纬傻恼{(diào)控、單個(gè)細(xì)胞在生物膜形成過程中扮演的角色以及生物膜與電極之間的電子傳遞途徑，為未來高效電活性生物膜的設(shè)計(jì)構(gòu)建、改善微生物的電催化應(yīng)用提供思路。

1 生物膜的形成過程和電子傳遞機(jī)制

通常，微生物電催化有三個(gè)連續(xù)過程：（1）在電能細(xì)胞內(nèi)部生物催化過程，通過氧化還原反應(yīng)消耗底物進(jìn)而產(chǎn)生電子。（2）通過不同途徑跨膜方式實(shí)現(xiàn)電子向胞外傳遞。（3）陰極或陽極上的電催化過程。電極需要為微生物的生長和營養(yǎng)供應(yīng)提供良好的環(huán)境，而微生物應(yīng)該能夠運(yùn)輸大量的細(xì)胞外電子，以便在電極上進(jìn)行快速的氧化還原反應(yīng)。在這種情況下，微生物電催化過程要求微生物和電極要有高強(qiáng)度的電子傳遞效率，電極上能否形成高電活性生物膜在促進(jìn)微生物電催化方向上具有重大的意義。

1.1 電活性生物膜的形成過程

圖1 生物膜形成過程Fig.1 The formation process of electroactive biofilm

電活性生物被膜的形成過程（圖1）可以分為四個(gè)階段：階段一涉及細(xì)胞與電極表面的可逆附著。即電極附近微環(huán)境的離子強(qiáng)度、滲透壓、pH 和營養(yǎng)條件等均不同于液體環(huán)境，浮游的細(xì)菌細(xì)胞識別出將要附著的電極表面并啟動(dòng)附著過程。首先細(xì)菌細(xì)胞表面會(huì)表現(xiàn)出理化性質(zhì)的改變；隨后，細(xì)菌細(xì)胞的鞭毛和菌毛先后進(jìn)行附著，鞭毛和菌毛不僅增強(qiáng)與電極表面的黏附，同時(shí)起信號傳遞作用，促進(jìn)胞內(nèi)第二信使的產(chǎn)生，使細(xì)菌胞內(nèi)對這種黏附作出響應(yīng)；在起始附著階段后期，基于酸堿作用力、范德華力、靜電力等作用，菌體在接觸電極表面后引起細(xì)胞膜形變，最終完成與電極表面的可逆附著[13]。在生物膜形成的第二階段，在群體感應(yīng)信號分子的表達(dá)和細(xì)胞外聚合物的形成介導(dǎo)下，細(xì)菌細(xì)胞不可逆地附著在基質(zhì)表面。第三階段涉及形成具有三維結(jié)構(gòu)的成熟生物膜，該生物膜包含堆積成簇的細(xì)胞，簇之間具有通道，允許水和養(yǎng)分的運(yùn)輸以及代謝廢物的排出。在階段四，細(xì)菌細(xì)胞生物膜逐漸分離和分散，并開啟新的生物膜形成。分散的細(xì)胞在形態(tài)上更類似于浮游細(xì)胞，并非成熟的生物膜細(xì)胞，浮游細(xì)胞對于再次發(fā)展成新的生物膜至關(guān)重要[14]。

1.2 電活性生物膜的電子傳遞機(jī)制

電能細(xì)胞依靠生物膜基質(zhì)大量地附著在電極周圍，如圖2 微生物和電極之間的胞外電子傳遞主要有兩種方式：（1）直接接觸式電子傳遞；（2）間接接觸式電子傳遞[15?17]。直接接觸式電子傳遞是指微生物細(xì)胞與電子受體/供體（電極）之間的直接接觸，通過外膜細(xì)胞色素和導(dǎo)電菌毛直接與電極傳遞電子。間接接觸式電子傳遞是通過可溶性電子載體(如黃素、吩嗪等)或?qū)щ娊橘|(zhì)（如氫氣、甲酸等），在細(xì)菌細(xì)胞和電極之間攜帶電子，而電子傳遞載體或?qū)щ娊橘|(zhì)可以是微生物自身分泌的有機(jī)或無機(jī)分子，也可以添加人工介質(zhì)來進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移。

圖2 電活性生物膜的電子傳遞機(jī)制Fig.2 Electron transfer mechanism of electroactive biofilm:direct electron transfer and indirect electron transfer

地桿菌Geobacter sulfurreducens 和希瓦氏菌Shewanella oneidensis 是微生物電催化最具有代表性的模式菌株，已具備完整的基因組序列信息和成熟的基因編輯技術(shù)。在G.sulfurreducens中具有多種類型的c 型細(xì)胞色素（c-Cyts）被認(rèn)為是直接電子傳遞的主要通道之一，它可以使電子從細(xì)胞膜醌池直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外不溶性受體。c-Cyts 在EET 過程中特別是外膜（OM）c-Cyts 中不可或缺的作用已得到充分驗(yàn)證。例如，OmcZ（電極上G. sulfurreducens 生物膜中富含的OM c?Cyts）的缺失導(dǎo)致電流下降70%～90%[18?19]。 對 于S. oneidensis，由mtrDEF-omcAmtrCAB 基因簇編碼的Mtr 色素系統(tǒng)，被確定為向胞外電子受體傳遞電子的直接接觸途徑[20?23]。缺少c?Cyts 基因的S. oneidensis 突變菌株產(chǎn)生的電流比野生型菌株少20%，相反在野生型中過表達(dá)mtrC 細(xì)胞色素時(shí)，觀察到的電流增加了35%[24]。但是當(dāng)氧化還原活性蛋白和電極表面之間的距離大于一定數(shù)值，電子傳遞速率就會(huì)隨著其距離的增加而呈指數(shù)式下降[25]，這表明由OM c-Cyts 控制的直接接觸途徑只能發(fā)生在生物膜最內(nèi)層的微生物種群中。在大多數(shù)情況下，由于微生物通常在電極上形成一層厚厚的生物膜，位于生物膜表層的菌還可以通過外膜延伸部分的距離促進(jìn)較厚生物膜的電子轉(zhuǎn)移[26?29]。

除通過OM c-Cyts 和納米導(dǎo)線進(jìn)行直接電子傳遞外，電能細(xì)胞還可以通過自身分泌的可溶性氧化還原活性化合物（包括初級和次級代謝產(chǎn)物）和胞外的氫氣、甲酸、Fe2+、NH3等作為電子介體，促進(jìn)MFC 中陽極微生物的胞外電子間接式電子傳遞。這種電子傳遞機(jī)制隨內(nèi)源性電子介體和外生電子性質(zhì)變化，如Shewanella 和假單胞菌Pseudomonas 都可以進(jìn)行間接電子傳遞[30?34]。Shewanella 胞外電子傳遞的70%以上的電荷是由黃素類化合物作為介質(zhì)進(jìn)行傳遞的[35?37],黃素類（包括黃素單核苷酸和核黃素）已被確定為主要的胞外電子傳遞載體[37?41]。另外，Pseudomonas 能夠自身分泌吩嗪類化合物（例如吩嗪?1?羧酸，吩嗪?1?羧酰胺和綠膿菌素）作為電子傳遞載體[32?33,42]。Rabaey 等[32]揭示了綠膿菌素和吩嗪?1?羧酰胺能極大地促進(jìn)銅綠假單胞菌株KRP1 的胞外電子傳遞速率，吩嗪分泌不足能導(dǎo)致突變菌株的功率輸出降低近95%。此外，在混合菌培養(yǎng)中分泌的吩嗪不僅可以被假單胞菌自身使用，而且還可以被其他細(xì)菌利用，也能顯著提高功率輸出和胞外電子傳遞效率[33,42]。

2 合成生物學(xué)改造生物膜

在自然狀態(tài)下，電能細(xì)胞形成的生物膜因厚度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物量等因素限制，嚴(yán)重制約了電子傳遞效率。近年來，借助合成生物學(xué)手段，通過改進(jìn)擴(kuò)展現(xiàn)有生物學(xué)工具、重構(gòu)基因調(diào)控線路、引入新功能模塊等方式來改善電活性生物膜仍是國際研究的熱點(diǎn)。本節(jié)綜述了近五年國內(nèi)外利用合成生物學(xué)方法從生物膜的結(jié)構(gòu)成分、穩(wěn)定性和導(dǎo)電性三大方面進(jìn)行改造的研究進(jìn)展。

2.1 合成生物學(xué)改造胞內(nèi)信號分子

2.1.1 c?di?GMP 合 成 及 調(diào) 控 環(huán) 狀 二 核 苷 酸(cyclic dinucleotides, CDNs)是一種高度通用的信號分子，控制著細(xì)菌中各種重要的生物學(xué)過程[43]，環(huán)二鳥苷酸（cyclic diguanylate, c?di?GMP）作為最廣泛研究的CDNs，是一種幾乎無處不在的第二信使分子，參于調(diào)控細(xì)菌生長和生理生化的各個(gè)方面，包括活力、毒性、生物膜的形成和細(xì)胞周期。細(xì)胞內(nèi)含有GGDEF 結(jié)構(gòu)域的蛋白與底物GTP 結(jié)合，催化c?di?GMP 生成。游離的c?di?GMP 進(jìn)而可以抑制鞭毛的合成，促進(jìn)胞外多糖的分泌以及Type Ⅳ型菌毛的表達(dá)[44?45]。此外，c?di?GMP 作為細(xì)胞內(nèi)一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)器，通過濃度變化調(diào)節(jié)細(xì)胞附著和分離狀態(tài)進(jìn)而控制生物膜的穩(wěn)定性[46]。

Liu 等[47]在S.oneidensis 中采用構(gòu)建IPTG 誘導(dǎo)型和組成型兩種啟動(dòng)子方案來過表達(dá)控制c?di?GMP生物合成的基因ydeH，通過提高S.oneidensis胞內(nèi)c?di?GMP 濃度增強(qiáng)了工程菌的生物膜形成能力[圖3(a)]。相對于野生菌，工程菌在電極上形成了致密的生物膜，并且極大地加強(qiáng)了以c 型細(xì)胞色素介導(dǎo)的直接接觸式胞外電子傳遞效率。最終工程菌株的MFCs 實(shí)現(xiàn)了167.6 mW/m2的功率密度，是野生型的2.8 倍。生物膜的增長通過促進(jìn)生物量的增加來加快胞外電子傳遞速率，此方法為合成生物學(xué)工程改造生物膜提供了思路。表達(dá)相關(guān)合成基因提高產(chǎn)電菌胞內(nèi)c?di?GMP 的濃度可以增強(qiáng)菌的生物催化能力，反之通過表達(dá)降解基因可以減弱生物催化能力，Benedetti 等[48]通過表達(dá)第二信使相關(guān)合成基因yedQ 和降解基因yhjH 控制惡臭假單胞菌Pseudomonas putida 中c?di?GMP 的水平，yedQ 的表達(dá)提高了c?di?GMP 的濃度從而促進(jìn)了菌株生物膜的形成，yhjH 的表達(dá)可以增強(qiáng)第二信使分子向GMP轉(zhuǎn)化，降低生物膜形成，由此來調(diào)控P.putida在浮游狀態(tài)和生物膜狀態(tài)之間切換[圖3(b)]。這些結(jié)果表明，通過設(shè)計(jì)基因線路，可實(shí)現(xiàn)對微生物的生物催化能力的調(diào)控。

圖3 合成生物學(xué)改造胞內(nèi)信號調(diào)控分子(a)細(xì)胞內(nèi)第二信使分子c?di?GMP調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的成分,促進(jìn)電活性生物膜的形成[47];(b)c?di?GMP濃度控制細(xì)菌生物膜的形成和降解,生物膜的產(chǎn)量直接影響細(xì)菌的生物催化能力[48];(c)光信號和誘導(dǎo)劑共同控制細(xì)胞內(nèi)信號分子產(chǎn)生電活性生物膜[49];(d)利用光信號增強(qiáng)生物膜增加色氨酸的產(chǎn)量[50]Fig.3 Synthetic biology methods to engineer intracellular signaling molecules(a)The intracellular second messenger molecule c?di?GMP regulates the components on the cell surface and promotes the formation of electroactive biofilms[47];(b)The concentration of c?di?GMP controls the biofilm formation and degradation of bacteria,and the yield of biofilm directly affects the biocatalytic capacity of bacteria[48];(c)Optical signals and inducers jointly control intracellular signal molecules to produce electroactive biofilm [49];(d)Increased production of tryptophan by photosignal enhanced biofilms [50]

此外，除表達(dá)第二信使分子相關(guān)的合成基因，也可以利用光響應(yīng)來控制菌內(nèi)c?di?GMP 水平。Hu等[49]在E.coli 中利用近紅外光響應(yīng)c?di?GMP 模塊構(gòu)建一種基于生物膜的新型邏輯門，用誘導(dǎo)劑IPTG和近紅外光譜光作為輸入信號并輸出電信號供給MFCs[圖3(c)]。該模塊包括工程蛋白BphS(一種菌體光敏色素c?di?GMP 合成酶)和BphO(一種異源發(fā)色團(tuán)膽綠素合成酶)。BphS 包含兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是光感受器域(PAS?GAF?PHY)，它與吸收光的發(fā)色團(tuán)膽綠素結(jié)合，一個(gè)是DGC輸出域(GGDEF)，可以合成胞內(nèi)c?di?GMP 增強(qiáng)生物膜的形成。在近紅外光譜下激活DGC 活性，IPTG 誘導(dǎo)直接控制人工bphS?bphO 操縱子。因此，當(dāng)IPTG 和近紅外光同時(shí)存 在 時(shí)，表 達(dá) 的BphS 具 有DGC 活 性，導(dǎo) 致c?di?GMP 水平升高，進(jìn)而增強(qiáng)陽極生物膜的形成，增加胞外電子傳遞。

在綠色化學(xué)合成中，Hu 等[50]使用近紅外光響應(yīng)基因電路調(diào)控胞內(nèi)c?di?GMP 的濃度來調(diào)節(jié)生物膜形成，通過生物膜催化吲哚轉(zhuǎn)化為色氨酸，近紅外光譜增強(qiáng)生物膜的形成促使色氨酸產(chǎn)量增加30%[圖3(d)]。這表明利用光譜進(jìn)行調(diào)節(jié)生物膜的形成可以影響膜結(jié)構(gòu)催化化學(xué)生產(chǎn)的可行性，光譜調(diào)控c?di?GMP 的合成能力進(jìn)而影響生物膜形成的方法將在未來促進(jìn)以生物膜介導(dǎo)的生物電催化提供廣闊的借鑒方法。

2.1.2 QS 系統(tǒng)調(diào)控生物膜形成 細(xì)菌群體感應(yīng)（quorum sensing,QS）是細(xì)菌細(xì)胞之間通過感受自誘導(dǎo)物來調(diào)控細(xì)菌群體行為的現(xiàn)象。這種細(xì)胞間通過群體感應(yīng)進(jìn)行的通訊最早發(fā)現(xiàn)在海洋生物發(fā)光細(xì)菌費(fèi)氏弧菌中[51]。群體感應(yīng)信號分子在革蘭陽性細(xì)菌和革蘭陰性細(xì)菌中有所不同，主要分為三類:①LuxI/R型信號系統(tǒng)。大部分革蘭陰性細(xì)菌中的信號分子N??；呓z氨酸內(nèi)酯（N?acyl?homoserine lactones, AHLs）參與群體感應(yīng)，AHLs 由LuxI 酶合成，在細(xì)胞內(nèi)不斷累積后利用特定的傳輸系統(tǒng)向胞外分泌，其濃度達(dá)到一定閾值后就會(huì)與相應(yīng)的受體蛋白LuxR 結(jié)合，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)[52]。②小分子多肽介導(dǎo)的信號分子。存在于革蘭陽性細(xì)菌中的寡肽型群體感應(yīng),該系統(tǒng)主要利用修飾后的小分子多 肽（anto?inducing peptides, AIPs）作 為 信 號 分子[53]。③luxS/AI?2 型信號分子。在兩種菌屬間參與的群體感應(yīng)luxS調(diào)控信號分子（autoinducer 2,AI?2)[54]。QS 系統(tǒng)在生物膜的形成、胞外多糖的合成、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和趨化性方面起著至關(guān)重要的作用，這對于細(xì)菌在降解環(huán)境污染物中的應(yīng)用必不可少[55]。因此，QS 系統(tǒng)的遺傳調(diào)節(jié)將有助于BES 的生產(chǎn)，以及制造具有高效環(huán)境適應(yīng)性的工程化生物膜。

Monzon 等[56]在高鹽MFCs 中添加喹諾酮類微量誘導(dǎo)物（外源QS 信號）分子來促進(jìn)細(xì)胞群體感應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組分析證實(shí)了群體感應(yīng)是通過增加多糖相關(guān)生物合成基因的表達(dá)，多糖是維持細(xì)菌細(xì)胞在生物膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要成分，增強(qiáng)的表面附著力和抗性促進(jìn)了生物膜的形成。該研究中100 nmol/L 的添加量使生物膜質(zhì)量增加了95%，產(chǎn)生的功率密度持續(xù)增加了30%。在共聚焦顯微鏡觀察下，細(xì)菌附著在陽極表面能力明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，添加QS信號獲得高電活性生物膜的方法能夠?qū)Ω啕}分廢水等進(jìn)行生物處理，并且可以在將來擴(kuò)大MFCs 在其他領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。Zhou 等[57]研究還發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性細(xì)菌最常見的QS 信號分子（AHL）對混合培養(yǎng)的電活性生物膜，尤其是細(xì)胞外聚合物和利用EAB 內(nèi)部直接電子轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響。結(jié)果表明，外源性和內(nèi)源性AHL 均起著調(diào)節(jié)劑的作用。內(nèi)源性AHL 調(diào)控下的MFCs 能量回收率從20.5%±3.9%增加到28.3%±4.1%，外源性AHL 調(diào)控下能量回收率進(jìn)一步提高到36.2%±5.1%，并且在內(nèi)源性AHL 調(diào)控下MFC 的啟動(dòng)時(shí)間從13 d 縮短到10 d，存在外源性AHL 的情況下進(jìn)一步減少至4 d。外源性和內(nèi)源性的AHL 改善了電極上的生物量、生物膜致密性和活/死細(xì)胞比例，從而獲得了優(yōu)異的電活性生物膜。

2.2 合成生物學(xué)改造電活性生物膜結(jié)構(gòu)成分

微生物的聚集狀態(tài)主要是通過胞外聚合物（extracellular polymeric substances,EPS）形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連接聚合在一起，是維持生物膜結(jié)構(gòu)的胞外基質(zhì)，將生物膜內(nèi)單個(gè)菌體結(jié)合在一起保護(hù)它們免受外界惡劣環(huán)境的影響，生物膜基質(zhì)成分包括多聚糖、蛋白質(zhì)，胞外DNA（extracellular DNA, eDNA）等[58?59]，占EPS 有機(jī)物總量的70%～80%。EPS 在電活性微生物的生存和生長過程中起著重要作用，EPS 有助于電能細(xì)胞附著于電極表面。此外，EPS還為生物膜內(nèi)細(xì)胞提供保護(hù)，使其免受各種環(huán)境壓力的影響，例如pH 變化、滲透壓和紫外線輻射等[60]。在本節(jié)中，分別綜述了EPS 的主要成分在合成生物學(xué)中的改造研究進(jìn)展。

2.2.1 胞外多糖 胞外多糖是EPS基質(zhì)中的主要組成部分。 如在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中，與生物膜形成相關(guān)的多糖主要是Psl、Pel和海藻酸鹽多糖[61]，Psl是富含半乳糖的胞外多糖，而Pel 是富含甘露糖的胞外多糖，分別由多糖合成基因座的psl和pel編碼[62]。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并非所有多糖都有助于附著。細(xì)胞外聚合物基質(zhì)的主要作用是促進(jìn)微生物細(xì)胞附著在生物或非生物表面上。Zhang 等[63]開發(fā)了合成基因電路，利用CRISPRi/ dCas9 調(diào)節(jié)胞外多糖基因wcaf 來控制大腸桿菌生物膜厚度，wcaF 編碼合成大腸桿菌中莢膜異多糖酸，它是大腸桿菌EPS 中的關(guān)鍵多糖。當(dāng)抑制wcaF 時(shí)，生物膜的形成被抑制，并且在一段時(shí)間內(nèi)生物膜的厚度可以保持在一定水平。該方法表明可以通過調(diào)控基質(zhì)中多糖來控制和維持生物膜厚度，即根據(jù)所需在相關(guān)應(yīng)用中智能控制生物膜厚度具有巨大的潛力。

2.2.2 eDNA eDNA 是EPS 主要成分之一，它是細(xì)菌通過自身分泌、細(xì)菌裂解等作用釋放到胞外的核酸分子。對細(xì)菌在固體表面形成生物膜的初始黏附性，以及生物膜的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有重要作用[64?65]。因此，改造eDNA 可以獲得更理想的生物膜。已有研究證明eDNA 可由群體感應(yīng)來調(diào)控[66]，Das等[67]通過調(diào)節(jié)N?乙酰高絲氨酸內(nèi)酯的濃度和假單胞菌喹諾酮信號(PQS)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)來控制eDNA 的釋放。eDNA 還與胞外基質(zhì)中的菌毛、蛋白質(zhì)交織在一起共同維持生物膜的空間結(jié)構(gòu)[64,68]。

大量研究表明eDNA 與EPS 其他基質(zhì)成分之間存在復(fù)雜的相互作用。例如，①eDNA 結(jié)合蛋白，在胞外黏性蛋白可作為eDNA 之間的連接點(diǎn)[69?70];②β毒素，一種分泌的毒力因子，在eDNA 存在下交聯(lián)并形成不溶的核蛋白復(fù)合物[71]；③Type Ⅳ型菌毛結(jié)合eDNA 并引導(dǎo)運(yùn)動(dòng)；④多糖與eDNA 共定位[72]；⑤eDNA 與生物膜來源的膜囊泡相互作用；⑥綠膿菌素嵌入eDNA以促進(jìn)細(xì)胞間相互作用[73]。

2.2.3 curli curli是許多腸桿菌科產(chǎn)生的細(xì)胞外復(fù)雜基質(zhì)的主要蛋白成分，在生物膜形成過程中是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的吸附能力、促使成熟的生物膜形成、細(xì)胞間相互作用和穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)等重要功能[74]。近年來，curli 被應(yīng)用于電能細(xì)胞導(dǎo)電生物膜。Seker 等[75]通過使用可誘導(dǎo)合成的核糖體調(diào)節(jié)電路，將自組裝的curli 纖維與金納米粒子等無機(jī)材料連接，從而使生物膜具有導(dǎo)電性能[圖4(A)]。利用導(dǎo)電肽序列實(shí)現(xiàn)導(dǎo)電生物膜的合成，使不導(dǎo)電的大腸桿菌生物膜轉(zhuǎn)換成可導(dǎo)電形式與電極連接[76]。Yong 等[77]建立了一種新的合成生物學(xué)方法來加強(qiáng)細(xì)胞和電極的相互作用，將融合了金屬結(jié)合域的納米curli 雜化纖維均勻表達(dá)于細(xì)胞表面，實(shí)現(xiàn)了與不銹鋼電極的高效結(jié)合，使陽極輸出功率提高了約420 倍，并大大提高了陰極庫侖效率[圖4(B)]。這對微生物電催化解決與環(huán)境和能源相關(guān)的問題提供了一個(gè)前沿解決方案。此外，生物膜作為生產(chǎn)自組裝功能材料的生物平臺[78]，Joshi 等[79]提出了生物膜集成納米纖維顯示作為細(xì)菌細(xì)胞外基質(zhì)材料的策略，在大腸桿菌生物膜中占主導(dǎo)地位的蛋白組分?淀粉樣蛋白CsgA上添加肽結(jié)構(gòu)域，CsgA 是大腸桿菌生物膜curli 的主要成分，這些工程CsgA 融合蛋白被成功地分泌并在細(xì)胞外自組裝成淀粉樣納米纖維網(wǎng)絡(luò)，從而保留了肽結(jié)構(gòu)域的功能，并促進(jìn)納米顆粒生物模板化、底物黏附和位點(diǎn)特異性蛋白在結(jié)合系統(tǒng)上的固定。利用結(jié)合賦予生物膜基質(zhì)多種人工功能，為細(xì)胞外聚合物基質(zhì)創(chuàng)造新的電活性生物膜方法奠定了基礎(chǔ)。

2.2.4 胞外蛋白 生物膜基質(zhì)中包含有大量的胞外蛋白，且質(zhì)量可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過胞外多糖含量。Zhou等[80]發(fā)現(xiàn)了S.oneidensis MR?1 中生物膜形成的分子機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)編碼此過程涉及的7 種蛋白質(zhì)的基因簇。首次詳細(xì)研究了三個(gè)關(guān)鍵蛋白BpfA，BpfG 和BpfD。發(fā)現(xiàn)BpfA 以細(xì)胞外“膠水”的形式直接參與生物膜的形成；BpfG 直接影響B(tài)pfA 的分泌，而且還可以將BpfA 轉(zhuǎn)變成活性形式參與生物膜分散。BpfD 可能參與對信號分子c?di?GMP 的響應(yīng)，通過與BpfA 和BpfG 相互作用來調(diào)節(jié)生物膜的發(fā)育。S.oneidensis COAG 菌株是S.oneidensis MR?1的高度聚集突變體[81]，與野生型相比，COAG 在玻璃載體材料上的生物膜形成增加。通過DNA 微陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)分析COAG 中外膜蛋白的表達(dá)變化，并與MR?1 進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌高度聚集狀態(tài)與凝集蛋白aggA 的分泌有關(guān)。aggA 蛋白以成團(tuán)和絮凝體的形式調(diào)節(jié)微生物的聚集，成團(tuán)的菌體使生物膜在電極表面更加穩(wěn)定，從而持續(xù)增強(qiáng)生物膜的電活性。

2.3 合成生物學(xué)改造電活性生物膜的導(dǎo)電性

2.3.1 基于導(dǎo)電細(xì)胞色素的改造 改造電能細(xì)胞的導(dǎo)電色素系統(tǒng)能促進(jìn)電活性生物膜在MFCs 電極上的形成[24]，電活性生物膜促進(jìn)電能細(xì)胞直接接觸電子傳遞，同時(shí)在胞內(nèi)表達(dá)電子傳遞載體化合物（核黃素、吩嗪和醌類），實(shí)現(xiàn)兩種電子傳遞機(jī)制共同促進(jìn)高電活性生物膜的形成。Shewanella 總胞外電子傳遞的70%以上的電荷是由電子傳遞載體作為介質(zhì)進(jìn)行傳遞的[35?37]，異源引入電子傳遞載體合成鏈能極大增強(qiáng)產(chǎn)電微生物的產(chǎn)電能力，同時(shí)會(huì)增強(qiáng)電活性生物膜的形成，二者共同促進(jìn)電能細(xì)胞的胞外電子傳遞。例如，Min 等[82]在S.oneidensis MR?1 共同表達(dá)了黃素生物合成基因簇（ribD-ribCribBA-ribE）和色素生物合成基因簇（mtrC-mtrAmtrB），與對照菌株相比，工程菌株能在電極上形成厚的電活性生物膜，在微生物燃料電池和恒電位控制的電化學(xué)電池中表現(xiàn)出更好的胞外電子傳遞能力，最大電流密度增加了約110%和87%（圖5）。改造的工程菌直接促進(jìn)了直接電子傳遞和間接電子傳遞兩種機(jī)制，該耦合表達(dá)的研究結(jié)果也為未來改造厚的電活性生物膜提供了有效策略。這對電活性生物膜在環(huán)境修復(fù)、廢水處理和廢棄物生物能源回收中的應(yīng)用至關(guān)重要。

圖4 合成生物學(xué)改造基于curli的電活性生物膜(A)基于卷曲纖維形成的導(dǎo)電生物膜的原理圖,使用核調(diào)控的CsgA電路以及在卷曲纖維上存在檸檬酸鈉和金(III)氯化物的情況下控制金納米顆粒的形成[75];(B)合成curli生產(chǎn)電催化電活性生物膜[77];(a)電活性細(xì)菌中curli合成的示意圖;(b)帶有用于發(fā)電的不銹鋼陽極的電活性生物膜;(c)具有用于CO2還原或反硝化的不銹鋼陰極的電活性生物膜Fig.4 Engineering curli?based electroactive biofilm by synthetic biology methods(A)Schematic of the conductive biofilm based on curli fiber formation using a riboregulated CsgA circuitry along with controlled gold nanoparticle formation in the presence of sodium citrate and gold(III)chloride on curli fibers[75];(B)Synthetic curli produces electrocatalytic electroactive biofilms[77];(a)Schematic of the curli synthesis in electroactive bacteria;(b)Electroactive biofilms with stainless steel anode for electricity production;(c)Electroactive biofilms with stainless steel cathode for CO2 reduction or denitrification

2.3.2 基于胞間電子傳遞介質(zhì)的改造 電能細(xì)胞可以利用無機(jī)(H2、H2S、Fe3+等)或有機(jī)化合物(黃素、吩嗪等)作為電子傳遞載體，介導(dǎo)細(xì)胞與電極表面之間的電子傳遞[83]。例如，S.oneidensis 合成的核黃素(RF)、黃素單核苷酸(FMN)等黃素類物質(zhì)和P.aeruginosa合成的吩嗪?1?羧酸、綠膿素(PYO)等吩嗪衍生物均可作為電子高效傳遞的載體。Marsili 等[84]證明，從產(chǎn)電菌生物膜中去除黃素類物質(zhì)可使胞外電子傳遞降低70%，表明黃素類化合物在可溶性氧化還原反應(yīng)中起著將電子從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移到陽極的作用。最近的電化學(xué)分析表明，S.oneidensis MR?1 自分泌的黃素不僅作為電子載體，還可作為與外膜型細(xì)胞色素結(jié)合的氧化還原輔因子，導(dǎo)致胞外電子傳遞動(dòng)力學(xué)顯著增強(qiáng)。

促進(jìn)電子傳遞載體的生物合成和分泌是提高生物膜導(dǎo)電性的有效途徑。大量的黃素將電子從外膜傳遞到細(xì)胞外基質(zhì)，有研究表明色素系統(tǒng)通過瞬時(shí)結(jié)合核黃素在胞外電子傳遞中起作用[41]，色素系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)其他胞外電子傳遞途徑的重要通道。Yang 等[85]將枯草芽孢桿菌中編碼核黃素合成的核心基因簇(ribADEHC)在S.oneidensis MR?1中異源表達(dá)，經(jīng)過IPTG 的誘導(dǎo)工程菌分泌的黃素（核黃素和黃素腺嘌呤二核苷酸）濃度增加25.7 倍，直接提高了電子傳遞載體的胞外電子傳遞，同時(shí)電極上的生物附著量提高了近一倍，促進(jìn)了以色素系統(tǒng)等直接接觸式的電子傳遞路徑。該黃素合成模塊顯著增強(qiáng)MR?1 雙向電子傳遞能力,使得微生物燃料電池的最大輸出功率增加了13.2 倍,向內(nèi)電流增加了15.5倍，結(jié)果表明，加強(qiáng)電子傳遞載體的生物合成和分泌是提高生物膜導(dǎo)電性和胞外電子傳遞效率的有效策略。

2.3.3 基于導(dǎo)電菌毛的改造 導(dǎo)電菌毛（pili）對菌在固體表面的黏附、振顫運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成都有很重要的作用，也對電能細(xì)胞的胞外電子傳遞具有直接的作用，增強(qiáng)pili 的導(dǎo)電性能促進(jìn)菌的直接接觸電子傳遞，提升生物膜的導(dǎo)電性能。在之前的研究中，Ajo?Franklin等[86]將S.oneidensis的胞外電子傳遞色素蛋白(CymA、MtrA、MtrB、MtrC)引入非產(chǎn)電菌大腸桿菌中，成功實(shí)現(xiàn)E.coli 產(chǎn)電，隨后Lienemann等[87]在這個(gè)基礎(chǔ)上引入能結(jié)合甘露糖的pili，將細(xì)胞附著在甘露糖涂層材料上形成電活性生物膜[圖6(a)]。在電活性生物膜內(nèi)部，表達(dá)的色素系統(tǒng)持續(xù)地將電子傳遞到胞外，促進(jìn)了以色素系統(tǒng)為直接接觸的電子傳遞能力?；趐ili 構(gòu)建導(dǎo)電生物膜的方法為新型的微生物電催化提供了良好的思路。

圖5 合成生物學(xué)改造生物膜的導(dǎo)電性[82](a)通過耦合改善黃素合成和細(xì)胞色素來提高生物膜的導(dǎo)電性;(b)表達(dá)載體的質(zhì)粒示意圖;(c)黃酮和細(xì)胞色素介導(dǎo)的MR?1的EET通路示意圖;胞內(nèi)電子通過CymA和MtrA到達(dá)外膜細(xì)胞色素c(OmcA和MtrC);外膜與胞外電子受體之間的界面電子轉(zhuǎn)移可以通過直接接觸的EET、外膜細(xì)胞色素c或納米導(dǎo)線進(jìn)行,也可以通過黃素作為電子穿梭物介導(dǎo)的間接EET進(jìn)行Fig.5 Engineering electrical conductivity of biofilms by synthetic biology approaches [82](a)Enhancing electrical conductivity of biofilms through coupling improved flavin synthesis and cytochrome;(b)Schematic plasmid maps of expression vectors;(c)Schematic illustration of the flavin and cytochrome mediated EET pathway in S.oneidensis MR?1;Intracellular electrons flow through CymA and MtrA and come to outer membrane cytochrome c(OmcA and MtrC);The interfacial electron transfer between outer membrane and extracellular electron acceptors may occur by direct contact?based EET,via outer membrane cytochrome c or nanowires,or indirect EET mediated by flavin as electron shuttles

Tan 等[88]將G. metallireducens 中 編 碼Type Ⅳ型pili 菌毛基因PilA 在G. sulfurreducens 中進(jìn)行異源表達(dá)，得到一種導(dǎo)電性較好的導(dǎo)電菌毛(e?pili)。Geobacter 本身的pili 導(dǎo)電性較差，改造過后的菌株產(chǎn)生了大量的菌毛，提高了pili 的電導(dǎo)率。高電導(dǎo)率的菌毛是因?yàn)樾纬闪烁呙芏鹊姆枷阕灏被幔珿.sulfurreducens 菌毛末端羧基序列的特殊芳香氨基酸具有導(dǎo)電性[89]，這是沿菌毛進(jìn)行電子傳遞的重要組成部分。這些合成元件被設(shè)計(jì)用來調(diào)節(jié)電子傳輸，模仿自然電活性細(xì)菌的蛋白質(zhì)附屬物。在P.aeruginosa 中PilA 編碼組裝的pili 也具有高導(dǎo)電性[90]，通過增加P.aeruginosa 的pili 末端的芳香氨基酸數(shù)量，可以顯著提高菌毛的電導(dǎo)率。因此，如果能對pili 的外表面進(jìn)行修飾，使其具有新的傳感能力或增強(qiáng)與其他材料的結(jié)合，那么從G.sulfurreducens 菌中獲得的導(dǎo)電蛋白納米線的潛在應(yīng)用可能會(huì)大大擴(kuò)展。Ueki等[91]開發(fā)了一個(gè)簡單的策略，表面暴露肽使e?pili 功能化。對組裝pili 單體的基因進(jìn)行了修飾，使其在單體的羧基端添加肽標(biāo)簽，制備了具有暴露在外表面的肽標(biāo)簽合成e?pili。添加肽標(biāo)簽并沒有降低e?pili 的電導(dǎo)率，反而這種修飾可以按照需求合理控制表達(dá)，合成pili 可以幫助菌更緊密附著在電極表面，從而開發(fā)高導(dǎo)電生物膜[圖6(b)]。

3 展 望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷更新，對電活性生物膜的解析越來越多，包括代謝機(jī)理和區(qū)別于單個(gè)細(xì)胞群落的新特性，生物膜應(yīng)用在未來將會(huì)更加廣泛。目前對生物膜的研究仍不夠系統(tǒng)、徹底，可以從以下幾個(gè)方面作進(jìn)一步思考：（1）開發(fā)基因編輯工具，進(jìn)行多基因表達(dá)調(diào)控；（2）結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，在多組學(xué)指導(dǎo)下進(jìn)行特異性合成生物學(xué)改造；（3）從生物膜厚度、導(dǎo)電性、穩(wěn)定性、內(nèi)部代謝和結(jié)構(gòu)均質(zhì)性等角度協(xié)同工程化改造導(dǎo)電生物膜。

合成生物學(xué)的方法在指導(dǎo)生物膜改造上具有很多的技術(shù)優(yōu)勢性和便捷性，微生物強(qiáng)大的生物膜形成能力、自身的膜結(jié)構(gòu)強(qiáng)度以及高效率的性能對任何的領(lǐng)域應(yīng)用都有顯著的促進(jìn)作用。但是，調(diào)控生物膜的合成生物學(xué)方法仍處于早期階段。在生物膜發(fā)育的不同階段，多種因素同時(shí)或串聯(lián)起作用，而不是單個(gè)基因或信號分子。因此，可能需要多階段和多目標(biāo)策略來實(shí)現(xiàn)所需水平的生物膜控制，這可通過模擬自然生物膜的形成和擴(kuò)散過程來實(shí)現(xiàn)。不斷增加的合成生物學(xué)工具以及對生物膜調(diào)控的持續(xù)研究將為生物膜控制策略及其在醫(yī)療、食品加工、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用提供見解。

圖6 合成生物學(xué)改造基于pili的電活性生物膜(a)構(gòu)建的大腸桿菌系統(tǒng)的細(xì)胞包膜示意圖[87];外膜上的pili促進(jìn)與細(xì)胞色素系統(tǒng)直接接觸的電子傳遞;(b)通過改變pili的外表面獲得高導(dǎo)電性的生物膜[91];通過在單體的羧基端添加肽標(biāo)簽制備具有暴露表面的肽標(biāo)簽,合成了e?piliFig.6 Engineering electroactive biofilm based on pili by synthetic biology methods(a)Schematic of cell envelope of the constructed E.coli system[87];The pili on the outer membrane promotes electron transport in direct contact with the cytochrome system;(b)Highly conductive biofilm was obtained by modifying the outer surface of pili[91];e?pili was synthesized by adding a peptide tag to the carboxyl end of a monomer to prepare a peptide tag with an exposed surface

展望未來，開發(fā)出優(yōu)異的生物膜將賦予細(xì)菌在生產(chǎn)納米生物材料產(chǎn)業(yè)化成為可能，并有可能擴(kuò)展到化學(xué)品綠色合成領(lǐng)域。例如，將生物膜3D打印技術(shù)與合成遺傳控制技術(shù)相結(jié)合，細(xì)菌的3D打印用來創(chuàng)建基于生物膜的功能材料用于生物修復(fù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用；具有較高產(chǎn)量和對有毒抑制劑耐受性的生物膜能作為微生物細(xì)胞工廠，用于生產(chǎn)諸如乙醇、丙酮、丁醇和琥珀酸等化學(xué)品。合成生物膜群落在工業(yè)生化生產(chǎn)中將變得越來越重要，在21世紀(jì)合成生物學(xué)方法改造上也必將開拓出革命性的成果。