秦磊，俞杰，寧小鈺，孫文濤，李春，2

（1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院化學(xué)工程系生物化工研究所，北京100081； 2 清華大學(xué)化學(xué)工程系生物化工研究所/工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100084）

引 言

化石資源短缺和環(huán)境破壞問(wèn)題的日益加劇促使人們尋求一種綠色可持續(xù)的生物制造方式來(lái)生產(chǎn)燃料、藥品、大宗化學(xué)品和精細(xì)化學(xué)品。微生物細(xì)胞工廠的出現(xiàn)為高效且可持續(xù)的生產(chǎn)提供了新方法。在代謝工程、合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的協(xié)同發(fā)展下，通過(guò)微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)生物燃料、藥品、精細(xì)化學(xué)品等均取得了重大進(jìn)展[1?5]，利用大腸桿 菌（Escherichia coli）[6?7]、谷 氨 酸 棒 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）[8?9]及 酵 母（yeast）[10?14]等常用的微生物細(xì)胞工廠已實(shí)現(xiàn)了多種產(chǎn)品的生產(chǎn)。

目前，微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建與優(yōu)化仍存在著許多挑戰(zhàn)。一方面，微生物目標(biāo)合成途徑的強(qiáng)化會(huì)受到細(xì)胞本身復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的限制。無(wú)論是內(nèi)源途徑還是異源途徑，常會(huì)遇到目標(biāo)途徑通量低、代謝通量不平衡、競(jìng)爭(zhēng)途徑抑制及有毒中間產(chǎn)物積累等問(wèn)題，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)及生產(chǎn)受到抑制[15]。因此，對(duì)代謝途徑進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量最大化，是優(yōu)化微生物細(xì)胞工廠的一致方向。另一方面，工業(yè)發(fā)酵環(huán)境存在各種脅迫因素，如高溫、氧化、pH波動(dòng)、高滲透壓、有機(jī)溶劑、重金屬等因素，都會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)造成影響[16?22]。工廠對(duì)發(fā)酵條件的嚴(yán)格控制雖然可以提高菌株生產(chǎn)的穩(wěn)定性，但同時(shí)會(huì)增加大量成本，包括使用冷卻水、酸堿、過(guò)濾裝置等，并且增加了對(duì)環(huán)境的破壞。因此，提升工業(yè)菌株的魯棒性是提高產(chǎn)量和降低成本的根本解決方案。

提高生物制造過(guò)程的智能性是解決上述問(wèn)題的重要途徑。生物“智”造，即智能化的生物制造，是指微生物根據(jù)發(fā)酵的環(huán)境變化或發(fā)酵的不同階段進(jìn)行基因、轉(zhuǎn)錄、翻譯或蛋白質(zhì)水平的調(diào)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)更好的生長(zhǎng)或生產(chǎn)。生物制造的智能化可以使微生物動(dòng)態(tài)地調(diào)整自身，使其向更有利的方向發(fā)展。例如，在發(fā)酵生產(chǎn)一些毒性產(chǎn)物的過(guò)程中，要使菌株在發(fā)酵前期積累生物量，從而盡量減少產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害，在中后期再開(kāi)始合成產(chǎn)物并提高產(chǎn)量。又如，面對(duì)工業(yè)發(fā)酵罐中溫度和pH 等的局部波動(dòng)，要使菌株在脅迫環(huán)境下抵抗干擾，而在無(wú)脅迫時(shí)減少抗逆系統(tǒng)的能量消耗。

圖1 生物“智”造包括的主要內(nèi)容Fig.1 The brief contents of intelligent biological manufacturing

本文將從蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的智能化、生物傳感的智能化、代謝調(diào)控的智能化、菌株進(jìn)化的智能化及發(fā)酵過(guò)程的智能化五個(gè)方面來(lái)分別介紹（圖1）。隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，生物“智”造的智能化程度也將逐步加深，為提高發(fā)酵產(chǎn)量和節(jié)能減排做出重要貢獻(xiàn)。

1 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的智能化

通過(guò)定向進(jìn)化獲得目標(biāo)功能的蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的隨機(jī)性，而依靠計(jì)算機(jī)算法的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)則體現(xiàn)出智能性。利用大分子建模軟件Rosetta 等可以實(shí)現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、分子對(duì)接、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建模等任務(wù)[23]，并且隨著軟件功能的開(kāi)發(fā)、計(jì)算機(jī)運(yùn)算能力的提高以及設(shè)計(jì)方法的完善[24]，模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度也將進(jìn)一步提高。受限于人們目前的知識(shí)水平，完全從頭設(shè)計(jì)出目標(biāo)催化功能的酶還無(wú)法實(shí)現(xiàn)，但從頭設(shè)計(jì)出具有某些調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)蛋白已取得了一些重要突破。

1.1 蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)的智能化

蛋白質(zhì)的變構(gòu)調(diào)節(jié)功能在生物中廣泛存在，在生物過(guò)程調(diào)控中起到非常重要的作用。Baker 等[25]以α?螺旋為結(jié)構(gòu)單元設(shè)計(jì)出了一系列蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)元件。α?螺旋的模塊化程度較高，因此便于從頭設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)。通過(guò)Rosetta 設(shè)計(jì)的97對(duì)α?螺旋異源二聚體中，有65 對(duì)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證形成了預(yù)期的二聚體[25]，這表明盡管目前的計(jì)算機(jī)智能設(shè)計(jì)能夠預(yù)測(cè)正確大部分結(jié)果，但方法和技術(shù)仍有待完善。

研究者基于α?螺旋的異源二聚體或同源三聚體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出了pH 調(diào)控的二/三聚體解聚過(guò)程：在α?螺旋中插入組氨酸殘基，使組氨酸殘基在酸性條件下質(zhì)子化，增強(qiáng)了靜電和空間排斥作用，從而使多聚體解聚[圖2(a)]；由于α?螺旋單體能夠破壞磷脂膜，因此用該元件可實(shí)現(xiàn)pH 誘導(dǎo)的磷脂膜降解[26]。另外，對(duì)α?螺旋的長(zhǎng)度和親/疏水性進(jìn)行設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)酸性條件誘導(dǎo)α?螺旋在膜上聚合形成通道蛋白[27]。在自然界中也會(huì)發(fā)現(xiàn)一些pH 誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變構(gòu)。例如，李斯特菌溶血素O 是一種穿孔毒素，它的突變體Y406A 具有很強(qiáng)的pH 依賴性，只有在低pH 下才能形成通道[28]。通道的形成還受一些特異性蛋白的抑制，可受pH 和抑制蛋白的雙重調(diào)節(jié)[29]。

在α?螺旋同源三聚體的基礎(chǔ)上，研究者設(shè)計(jì)了一套蛋白質(zhì)開(kāi)關(guān)：通過(guò)加入“鑰匙”釋放“籠子”中的“門(mén)閂”[圖2(b)]。將“門(mén)閂”替換為降解決定子（能夠被泛素蛋白識(shí)別從而被降解），實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)降解，用此降解開(kāi)關(guān)實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子、Cas 蛋白以及信號(hào)傳遞途徑的調(diào)控[30?31]。

圖2 蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)的從頭設(shè)計(jì)(a)pH誘導(dǎo)的α?螺旋同源三聚體的解離[26];(b)基于α?螺旋的蛋白質(zhì)開(kāi)關(guān)[30]Fig.2 De novo design of tunable conformational changes of proteins(a)pH?induced dissociation of α?helix homotrimer[26];(b)α?helix based protein switch[30]

利用不同α?螺旋異源二聚體之間的正交性[25]，研究者設(shè)計(jì)出了各種蛋白質(zhì)的邏輯門(mén)[32]，這些邏輯門(mén)的功能幾乎不受宿主種類的影響，極大地豐富了合成生物學(xué)的可用元件。

1.2 酶催化的智能化

相較于α?螺旋的設(shè)計(jì)，酶的催化活性口袋的從頭設(shè)計(jì)則困難得多，因?yàn)樵O(shè)計(jì)對(duì)于小分子配體具有高度親和性和高度選擇性的蛋白質(zhì)仍無(wú)法十分精準(zhǔn)。研究者根據(jù)配體結(jié)合蛋白的基本設(shè)計(jì)原則，得到了能夠結(jié)合地高辛、孕酮和β ?雌二醇的蛋白質(zhì)[33]。

對(duì)天然的酶的智能化改造是目前更可行的方法。一些酶的雜泛性（promiscuity）使其催化的底物或產(chǎn)物不專一，使人們可以對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行微調(diào)，實(shí)現(xiàn)利用不同的底物生產(chǎn)不同的產(chǎn)物。例如，植物P450 酶在微生物中表達(dá)時(shí)通常表現(xiàn)出雜泛的區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性，可同時(shí)氧化不同的底物合成多種結(jié)構(gòu)類似物[34]?；谕唇Ｅc分子對(duì)接分析的理性設(shè)計(jì)，利用一個(gè)雜泛性的P450酶構(gòu)建了一系列具有特定功能的突變體，可識(shí)別具有不同性質(zhì)的底物并具有可控的氧化過(guò)程，實(shí)現(xiàn)稀有甘草三萜的特異性合成。此外，對(duì)影響P450酶氧化選擇性的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究，實(shí)現(xiàn)了特定底物的自動(dòng)選擇和特定產(chǎn)物的選擇性合成，從而為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)酶活性口袋的智能設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)[圖3（a）][35]。

另外，許多酶在細(xì)胞中都顯現(xiàn)出多種催化活性，并且催化活性受一些環(huán)境因素的影響。例如，DesK 是枯草芽孢桿菌的一個(gè)膜蛋白，在低溫（25°C）時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)催化結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出蛋白激酶活性，將轉(zhuǎn)錄因子DesR 磷酸化；在高溫（37°C）時(shí)，催化結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出磷酸酶活性，將DesR 去磷酸化[圖3（b）]。這是由于低溫時(shí)細(xì)胞膜流動(dòng)性差，高溫時(shí)細(xì)胞膜流動(dòng)性強(qiáng)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性使其厚度發(fā)生一些改變，影響蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域及連接肽的構(gòu)象變化，最終影響催化結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變[36]。

2 生物傳感的智能化

生物傳感是菌株智能化的基礎(chǔ)。合成生物學(xué)中的生物傳感器（biosensor）是指能夠感應(yīng)某種物理、化學(xué)或生物信號(hào)的生物學(xué)元件。生物傳感器具有兩種功能，一是“傳”，即傳遞信號(hào)，起到調(diào)節(jié)控制的作用，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和翻譯調(diào)節(jié)元件；二是“感”，即感應(yīng)信號(hào)，可以理解為信號(hào)的轉(zhuǎn)換輸出，如具有感應(yīng)功能的熒光蛋白等。

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件作為生物傳感器

啟動(dòng)子是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的最主要最直接的調(diào)控元件，其與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用可實(shí)現(xiàn)多種生物傳感器的功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的開(kāi)關(guān)或強(qiáng)度調(diào)節(jié)。下面介紹響應(yīng)幾種重要因素的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件類生物傳感器。

圖3 酶催化的智能化(a)利用酶的雜泛性合成不同產(chǎn)物[35];(b)通過(guò)調(diào)節(jié)溫度改變酶的性質(zhì)[36]Fig.3 Intelligence of enzymes(a)synthesis of various products by enzyme promiscuity[35];(b)changing properties of enzymes by regulating temperature[36]

2.1.1 糖或糖苷類 微生物中的碳源誘導(dǎo)機(jī)制常被用于基因表達(dá)的開(kāi)關(guān)，例如，原核細(xì)胞中經(jīng)典的異 丙 基 硫 代 半 乳 糖 苷（isopropyl β ?D?thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)[37]、阿拉伯糖誘導(dǎo)[38]、木糖誘導(dǎo)[39]等，酵母中經(jīng)典的半乳糖誘導(dǎo)[40?41]等。這些調(diào)控元件強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好，但是在發(fā)酵過(guò)程中需要一定的操作，不適合大多數(shù)工業(yè)發(fā)酵的需求。

2.1.2 酸 在原核生物中，Pasr是常用的質(zhì)子誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，在大腸桿菌中受PhoQP?RstBA 信號(hào)延遲級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的調(diào)控，在pH 低于5時(shí)強(qiáng)度明顯升高[42?43]，對(duì)其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)保守序列的突變可獲得一系列誘導(dǎo)強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子庫(kù)[44]。PcadBA是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，它受到膜信號(hào)蛋白CadC 的激活。在培養(yǎng)基中缺少賴氨酸時(shí)，賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LysP 與CadC 的跨膜域結(jié)合，抑制酸信號(hào)向啟動(dòng)子傳遞。因此，截除CadC的跨膜域可消除賴氨酸對(duì)PcadBA的干擾[45]。此外，研究者在大腸桿菌中開(kāi)發(fā)了一個(gè)乙酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PglnAP2s，通過(guò)對(duì)初始啟動(dòng)子+1 位置下游序列的截除提高了其嚴(yán)謹(jǐn)性和靈敏度[46]。

在酵母中，對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件類型的生物傳感器的研究還較少。研究者表征了一些啟動(dòng)子對(duì)酸或高溫的響應(yīng)情況，但都缺乏較高的強(qiáng)度和嚴(yán)謹(jǐn)性[47]。通過(guò)人工啟動(dòng)子的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，研究者在一個(gè)酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PYGP1的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，將核心啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行替換以及將上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行替換和插入，獲得了一個(gè)在酸性條件下具有高強(qiáng)度的人工合成啟動(dòng)子PCCW14[48]。

2.1.3 代謝物 小分子代謝物的生物傳感器可以通過(guò)理性設(shè)計(jì)的方法實(shí)現(xiàn)，主要思路是尋找能與目標(biāo)代謝物產(chǎn)生相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。研究者對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子進(jìn)行了系統(tǒng)性的整理，在數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘了一系列需要配體（小分子代謝物）參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及其作用的啟動(dòng)子，通過(guò)驗(yàn)證得到了15種代謝物誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，且驗(yàn)證了它們之間具有很好的正交性，并且在多種原核細(xì)胞中對(duì)它們進(jìn)行了驗(yàn)證[49]。

研究者發(fā)現(xiàn)來(lái)自枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)錄因子FapR對(duì)順式調(diào)節(jié)元件fapO具有抑制作用，而對(duì)大腸桿菌的啟動(dòng)子PGAP有激活作用，并且丙二酰輔酶A可與FapR 結(jié)合分別抑制對(duì)fapO 和PGAP的作用，因此，分別得到了丙二酰輔酶A 誘導(dǎo)與抑制的啟動(dòng)子系統(tǒng)[50?51]。

PhucR是在耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)尿酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子，尿酸能與HucR 結(jié)合，促進(jìn)PhucR的轉(zhuǎn)錄。對(duì)HucR 結(jié)合口袋的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變，篩選得到能夠結(jié)合香草醛和阿魏酸的突變體HucR?V7，實(shí)現(xiàn)對(duì)香草醛和阿魏酸的感應(yīng)。并對(duì)PhucR的?10區(qū)進(jìn)行飽和突變，進(jìn)一步提高了香草醛的誘導(dǎo)強(qiáng)度[52]。

Keasling 等[53]通過(guò)理性設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了響應(yīng)萜類合成重要前體—— 異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）的人工生物傳感器。在大腸桿菌中，用IPP 異構(gòu)酶Idi與阿拉伯糖轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域（AraC?DBD）融合，在無(wú)IPP 時(shí)，此人工轉(zhuǎn)錄因子與阿拉伯糖結(jié)合并誘導(dǎo)啟動(dòng)子PBAD；在有IPP時(shí)，Idi形成二聚體，無(wú)法與啟動(dòng)子結(jié)合，基因停止表達(dá)。在酵母中，用Idi 與轉(zhuǎn)錄因子Gal4 的DNA 結(jié)合域（DBD）、DNA 激活域（AD）分別融合，在有IPP 時(shí)，Idi 二聚體使DBD 與AD 靠近，激活RNA 聚合酶使PGAL10啟動(dòng)[圖4（a）][53]。由于酵母與大腸桿菌轉(zhuǎn)錄機(jī)制不同，在酵母中構(gòu)建完整的系統(tǒng)更為困難。此方法可同樣用于構(gòu)建其他物質(zhì)的人工生物傳感器，但需要對(duì)靈敏度、嚴(yán)謹(jǐn)性和專一性進(jìn)行精細(xì)的調(diào)節(jié)。利用蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的方法，理論上可以得到任何目標(biāo)化合物的傳感器：將計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的配體結(jié)合蛋白分別融合DBD和AD[54]，用此方法實(shí)現(xiàn)了地高辛和孕酮的感應(yīng)[55]。

另一種方法是從轉(zhuǎn)錄組學(xué)中挖掘響應(yīng)的啟動(dòng)子。 研究者對(duì)積累法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的菌株及不積累FPP 的菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)一些顯著上調(diào)與下調(diào)的基因，因此這些基因的啟動(dòng)子可作為天然的FPP生物傳感器，例如PgadE為FPP 抑制，PyrbL和PrstA為FPP 誘導(dǎo)[56]。此思路可應(yīng)用于挖掘各種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。

2.1.4 溫度 感應(yīng)溫度的啟動(dòng)子一般源于微生物自身的熱激蛋白或冷激蛋白的啟動(dòng)子。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，研究者表征了熱激蛋白啟動(dòng)子PHSP12和PHSP26在高溫等條件下的啟動(dòng)強(qiáng)度，其在某些條件下能夠受到高溫的誘導(dǎo)[47]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組挖掘到了一系列高溫誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，提供了更為全面的啟動(dòng)子響應(yīng)高溫變化的數(shù)據(jù)庫(kù)[57]。但是，若想在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)控制更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯?dòng)子，還需進(jìn)一步對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行人工改造與優(yōu)化。

λ 噬菌體中的pL/pR?cI857 系統(tǒng)常被用作大腸桿菌中的溫度誘導(dǎo)開(kāi)關(guān)。在低溫時(shí)，噬菌體蛋白cI857 形成二聚體，結(jié)合在啟動(dòng)子的oL 或oR 區(qū)域，阻礙RNA 聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合；在高溫時(shí)，cI857 解離，使啟動(dòng)子開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄[58]。

此外，研究者在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)控制嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牡蜏卣T導(dǎo)系統(tǒng)。煙草花葉病毒蛋白酶TEV 能對(duì)特定的氨基酸序列進(jìn)行切割，在來(lái)自于噬菌體434 的轉(zhuǎn)錄抑制因子cI434 中插入TEV 的切割位點(diǎn)。通過(guò)定向進(jìn)化得到低溫抑制的cI434 突變體及高溫抑制的TEV 突變體。因此，在低溫下，TEV 活性高，高效切割cI434，且cI434 活性低，不會(huì)抑制PR啟動(dòng)子，目標(biāo)蛋白表達(dá)；在高溫下，TEV 失活，且cI434 活性高，抑制PR啟動(dòng)子，目標(biāo)蛋白不表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)目標(biāo)蛋白融合一個(gè)蛋白酶mf?Lon 靶向的標(biāo)簽，并且用啟動(dòng)子PR聯(lián)合TetR 抑制因子抑制mf?Lon 的表達(dá)，這樣使目標(biāo)蛋白在高溫下可被快速降解，使開(kāi)關(guān)更加嚴(yán)謹(jǐn)[圖4（b）][59]。

圖4 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件作為生物傳感器(a)感應(yīng)IPP的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的理性設(shè)計(jì)[53];(b)低溫誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[59];(c)大腸桿菌中光誘導(dǎo)和光抑制表達(dá)系統(tǒng)[64];(d)釀酒酵母中光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)[65]Fig.4 Transcription regulatory elements as biosensors(a)rational design of IPP?response element[53];(b)cold?induced expression system[59];(c)light?induced and light?repressed expression system in E.coli[64];(d)light?induced expression system in S.cerevisiae[65]

2.1.5 細(xì)胞密度 群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）起到在細(xì)胞之間進(jìn)行調(diào)控的作用。細(xì)胞分泌的信息素在達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)通過(guò)磷酸化級(jí)聯(lián)傳遞到一些啟動(dòng)子，從而調(diào)控基因表達(dá)水平，例如枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子PsrfA[60]，對(duì)PsrfA保守序列的優(yōu)化以及上游序列的替換和截除，可以提高啟動(dòng)子的誘導(dǎo)強(qiáng)度[39]。在微生物中常用海洋細(xì)菌費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）中發(fā)現(xiàn)的LuxI?LuxR 系統(tǒng)進(jìn)行群體感應(yīng)調(diào)控。LuxI 可催化合成一種信號(hào)分子酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acylhomoserine lactone，AHL），隨著AHL 濃度的升高，AHL 結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LuxR，從而誘導(dǎo)啟動(dòng)子PluxR[61?62]。

2.1.6 光 在深海細(xì)菌斜視紅桿菌（Erythrobacter litoralis）中存在一種光敏DNA 結(jié)合蛋白EL222，此蛋白包含N 端的光?氧?電壓（light?oxygen?voltage，LOV）結(jié)構(gòu)域和C 端的DNA 結(jié)合域，當(dāng)接收藍(lán)光時(shí)，EL222可形成二聚體并結(jié)合特定的DNA 序列[63]。研究者在大腸桿菌中構(gòu)建了藍(lán)光誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)。將PluxI啟動(dòng)子中的反向重復(fù)序列替換為EL222 的結(jié)合序列，因此EL222 二聚體可結(jié)合在PluxI的?35 區(qū)并招募RNA 聚合酶，開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄。同時(shí)構(gòu)建了藍(lán)光抑制的 啟 動(dòng) 子 系 統(tǒng)，將PluxI的?35 至?10 序 列 替 換 為EL222 的結(jié)合序列，這樣二聚體結(jié)合在此處抑制了RNA 聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合[圖4（c）][64]。研究者在釀酒酵母中也構(gòu)建了光誘導(dǎo)和光抑制的系統(tǒng)。將EL222與轉(zhuǎn)錄激活蛋白VP16的轉(zhuǎn)錄激活域融合，當(dāng)接收藍(lán)光時(shí)，融合蛋白形成二聚體結(jié)合到啟動(dòng)子PC120上開(kāi)啟基因表達(dá)[圖4（d）]。將此系統(tǒng)與半乳糖操縱子系統(tǒng)相結(jié)合，用藍(lán)光誘導(dǎo)GAL80 的表達(dá)，Gal80 最終抑制PGAL1，實(shí)現(xiàn)藍(lán)光抑制基因表達(dá)的效果[65]。同時(shí)，研究者還構(gòu)建了紅光誘導(dǎo)[66]及綠光誘導(dǎo)系統(tǒng)[67?68]。三個(gè)系統(tǒng)具有很好的正交性，可以滿足多重誘導(dǎo)的需要。

2.2 翻譯調(diào)節(jié)元件作為生物傳感器

一些非編碼RNA（non?coding RNA，ncRNA）可以對(duì)蛋白質(zhì)翻譯進(jìn)行調(diào)控，它們一般會(huì)影響核糖體與mRNA 的結(jié)合，因此也被稱作核糖體開(kāi)關(guān)（riboswitch）。

2.2.1 溫度誘導(dǎo)的核糖體開(kāi)關(guān) 在原核生物中，一些ncRNA 形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可結(jié)合在一些基因的5′非翻譯區(qū)（5′?untranslated region，5′UTR），阻礙核糖體的翻譯進(jìn)程，當(dāng)溫度升高后，ncRNA 與DNA 脫離，開(kāi)啟翻譯過(guò)程。這種ncRNA可稱作RNA溫度計(jì)，解離溫度與RNA 溫度計(jì)的結(jié)構(gòu)是相關(guān)的，因此通過(guò)設(shè)計(jì)不同結(jié)構(gòu)的RNA 溫度計(jì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同溫度的響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)在不同的培養(yǎng)溫度下表達(dá)不同的蛋白[62,69]。

一些基因的5′UTR 本身也會(huì)受溫度的影響而影響其翻譯水平。例如，大腸桿菌中cspA 基因的5′UTR 二級(jí)結(jié)構(gòu)受溫度影響，在低溫時(shí)，這段RNA的結(jié)構(gòu)使核糖體更容易進(jìn)行翻譯；而在高溫時(shí)，RNA的結(jié)構(gòu)改變，使其難以結(jié)合核糖體進(jìn)行翻譯[70]。2.2.2 pH 誘導(dǎo)的核糖體開(kāi)關(guān) 研究者在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)pH 敏感的RNA 元件（pH?responsive RNA element，PRE），位于alx 基因上游的5′UTR。PRE在酸性條件下（pH5.0），其包含的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ribosome binding site，RBS）被覆蓋在莖環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)，無(wú)法結(jié)合核糖體進(jìn)行翻譯；在堿性條件下（pH8.0），PRE 的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使RBS 暴露出來(lái)并能夠與核糖體結(jié)合，從而開(kāi)啟翻譯[71?72]。通過(guò)對(duì)RBS 的替換和對(duì)RNA 聚合酶的優(yōu)化使PRE 的作用強(qiáng)度更高、泄露表達(dá)更低、pH敏感性更高[73]。

2.3 蛋白質(zhì)作為生物傳感器

蛋白質(zhì)類的生物傳感器除了前文提到的pH 誘導(dǎo)的α?螺旋構(gòu)象變化以外，還包括一些受信號(hào)分子調(diào)節(jié)的熒光蛋白，使其具有在線原位檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、谷胱甘肽、NAD(P)H 等物質(zhì)的功能。這些熒光蛋白探針為實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、抗氧化水平和代謝平衡等生理指標(biāo)提供了重要工具。關(guān)于這些熒光蛋白探針的綜述可詳見(jiàn)文獻(xiàn)[74?76]。

另外，蛋白質(zhì)類的生物傳感器還包括光誘導(dǎo)型的蛋白質(zhì)聚集/解離元件。來(lái)自擬南芥的Cry2 光解酶同源域可在藍(lán)光激發(fā)下形成寡聚態(tài)，通過(guò)點(diǎn)突變得到的Cry2olig 可使其聚合度提高，此外，將Cry2 與FUS 蛋白的N 端無(wú)序區(qū)融合也可提高聚合度，最終得到的融合蛋白FUSN?Cry2olig 可實(shí)現(xiàn)靈敏的光誘導(dǎo)聚集[77?79]。通過(guò)FUSN?FusionRed?Cry2olig 的蛋白融合，使這一系統(tǒng)在釀酒酵母中可行且可視化[80]。在藍(lán)藻（Synechocystis sp.）中發(fā)現(xiàn)的PixD和PixE蛋白組成了藍(lán)光誘導(dǎo)的PixELL 系統(tǒng)。在無(wú)光時(shí)，PixD 和PixE 形成多聚物；藍(lán)光誘導(dǎo)后，二者解離，PixE 形成單 體，PixD 形 成 二 聚 體[81?82]。在 釀 酒 酵 母 中，將FUSN?FusionRed?PixD 融 合，將FUSN?Citrine?PixE融合，獲得了可視化的光誘導(dǎo)解離系統(tǒng)[80]。

3 代謝調(diào)控的智能化

代謝調(diào)控的智能化是依靠智能調(diào)節(jié)基因線路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。智能調(diào)節(jié)基因線路主要由生物傳感器和效應(yīng)基因組成，生物傳感器負(fù)責(zé)接收信號(hào)并將信號(hào)傳遞給效應(yīng)基因，再由效應(yīng)基因產(chǎn)生作用蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的反饋（震蕩）、增強(qiáng)等調(diào)節(jié)，或?qū)崿F(xiàn)其他生物過(guò)程。根據(jù)智能調(diào)節(jié)基因線路的作用可分為提高產(chǎn)物產(chǎn)量和提高菌株魯棒性；根據(jù)智能調(diào)節(jié)基因線路的復(fù)雜程度可分為單一基因線路和邏輯門(mén)；根據(jù)智能調(diào)節(jié)基因線路的調(diào)控方式可分為一般動(dòng)態(tài)調(diào)控和自主動(dòng)態(tài)調(diào)控。

3.1 一般動(dòng)態(tài)調(diào)控

一般動(dòng)態(tài)調(diào)控是指在發(fā)酵過(guò)程中需要人工操作誘導(dǎo)條件來(lái)達(dá)到調(diào)控基因線路及細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程。例如，用酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子Pasr和低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子PcspA分別調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因invF 和分子伴侶基因sicA，InvF 與SicA 形成的復(fù)合物可激活啟動(dòng)子PsicA，在發(fā)酵過(guò)程中形成一個(gè)雙重誘導(dǎo)的“與門(mén)”；而用PsicA調(diào)控目標(biāo)基因的反義RNA，則可以抑制目標(biāo)蛋白的翻譯，形成一個(gè)“與非門(mén)”[44]。

CRISPRa/i 是目前常用于動(dòng)態(tài)調(diào)控的工具。研究者在大腸桿菌中構(gòu)建了由鼠李糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrhaPBAD誘導(dǎo)dCas9 來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制的CRISPRi 系統(tǒng)。通過(guò)dCas9 抑制基因mvaE 和mvaK1 調(diào)節(jié)了甲羥戊酸途徑的代謝通量，使番茄紅素的產(chǎn)量增加了8倍[83]。研究者利用脫落酸介導(dǎo)的ABI?PYL1 蛋白質(zhì)相互作用，設(shè)計(jì)了兩個(gè)融合蛋白MCP?ABI和PYL1?VP64，通過(guò)添加脫落酸使MCP與VP64融合，進(jìn)而招募RNA 聚合酶，實(shí)現(xiàn)CRISPRa 的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程[84]。另外，還可以在翻譯水平對(duì)dCas9 的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，在dCas9 基因中引入一個(gè)TAG 終止密碼子，該位點(diǎn)可被翻譯為一個(gè)合成型非天然氨基酸L?聯(lián)苯丙氨酸（L?biphenylalanine，BipA）。當(dāng)加入BipA 時(shí)，TAG可被翻譯，從而產(chǎn)生完整的有功能的dCas9 蛋白；當(dāng)沒(méi)有BipA 時(shí)，翻譯會(huì)在TAG 處中斷，產(chǎn)生截短的無(wú)功能的dCas9 蛋白，從而失去對(duì)目標(biāo)基因的抑制作用[85]。

但是，上述這種需要改變培養(yǎng)基成分的調(diào)控方式很難用于工業(yè)生產(chǎn)，因此需要一些可行的動(dòng)態(tài)調(diào)控手段，如光誘導(dǎo)等。用藍(lán)光調(diào)控釀酒酵母生產(chǎn)異丁醇，由于乙醇和異丁醇的合成存在競(jìng)爭(zhēng)前體物丙酮酸的關(guān)系，需要抑制乙醇的產(chǎn)生，但乙醇合成途徑中的丙酮酸脫羧酶是生長(zhǎng)必需的，完全敲除會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)。因此，設(shè)計(jì)用藍(lán)光誘導(dǎo)丙酮酸脫羧酶表達(dá)，用藍(lán)光抑制異丁醇合成關(guān)鍵基因ILV2 的表達(dá)，在發(fā)酵前期開(kāi)啟藍(lán)光，使細(xì)胞生長(zhǎng)，而在中后期關(guān)閉藍(lán)光或根據(jù)生長(zhǎng)提供脈沖光源，這種方法使異丁醇的產(chǎn)量提高了5倍[65]。

VioE 催化生成原脫氧紫色桿菌素（protodeoxyviolaceinate，PTDV），再經(jīng)VioC 催化生成脫氧紫色桿菌素（deoxyviolacein，DV，粉色）。但PTDV 容易自發(fā)被氧化產(chǎn)生前脫氧紫色桿菌素（prodeoxyviolacein，PDV，綠色）。因此，要提高脫氧紫色桿菌素的產(chǎn)量就要精確控制VioE 和VioC。通過(guò)光誘導(dǎo)聚集，用Cry2olig 分別與VioE 和VioC 融合，藍(lán)光誘導(dǎo)使VioE 和VioC 拉近距離，這樣避免了PTDV 的積累，提高DV 的轉(zhuǎn)化率；類似地，通過(guò)光誘導(dǎo)解離，將PixD 和PixE 分別與VioE和VioC融合，在無(wú)藍(lán)光下PixD 與PixE 聚合，拉近VioE 和VioC 的距離。此方法使合成DV的特異性提高了18倍[80]。

調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度和pH 等條件控制酶活，可以達(dá)到改變催化產(chǎn)物的目的。例如，在阿魏酸轉(zhuǎn)化香草醛的過(guò)程中設(shè)計(jì)了新的不依賴輔酶的催化過(guò)程，通過(guò)酚酸脫羧酶Pad催化香草醛生成中間產(chǎn)物對(duì)乙烯基愈創(chuàng)木酚，再通過(guò)芳香雙加氧酶Ado 催化產(chǎn)生香草醛。由于受細(xì)胞內(nèi)源的乙醇脫氫酶影響，一部分香草醛轉(zhuǎn)化為了香草醇，為防止這種副反應(yīng)產(chǎn)生，將反應(yīng)溫度提高至50°C，可使大部分乙醇脫氫酶失活。在提高溫度的同時(shí)提高pH 至9.5，由于Ado 催化的反應(yīng)為限速步驟，Ado在堿性下活性更強(qiáng)，且堿性進(jìn)一步降低乙醇脫氫酶活性，使目標(biāo)產(chǎn)物香草醛的轉(zhuǎn)化率明顯提高。因此，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)溫度和pH的調(diào)節(jié)改變產(chǎn)物比例的目的[86]。

3.2 自主動(dòng)態(tài)調(diào)控

自主動(dòng)態(tài)調(diào)控是指在發(fā)酵過(guò)程中不需要人工操作干預(yù)，菌株可自動(dòng)根據(jù)發(fā)酵條件變化調(diào)節(jié)自身狀態(tài)的過(guò)程。

3.2.1 自主動(dòng)態(tài)調(diào)控在產(chǎn)物合成中的應(yīng)用 在產(chǎn)物合成的自主動(dòng)態(tài)調(diào)控中，常會(huì)將積累量高的中間代謝物作為誘導(dǎo)物來(lái)負(fù)反饋抑制上游代謝途徑的基因，正反饋誘導(dǎo)下游代謝途徑的基因。例如，在青蒿素前體紫穗槐二烯的生物合成途徑中，F(xiàn)PP 為毒性中間產(chǎn)物，它的積累導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)受到影響。通過(guò)前文所述的FPP抑制的啟動(dòng)子和FPP誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)分別調(diào)控FPP上游途徑基因和下游途徑基因，分別形成反饋抑制和反饋誘導(dǎo)，通過(guò)FPP的量誘導(dǎo)FPP自身的轉(zhuǎn)化，降低了FPP的積累，提高了產(chǎn)物產(chǎn)量。此方法對(duì)比傳統(tǒng)的利用IPTG 誘導(dǎo)的調(diào)控方法更加智能，調(diào)控更加準(zhǔn)確，產(chǎn)量提高更明顯[圖5（a）][56]。類似地，在脂肪酸的合成途徑中，利用丙二酰輔酶A誘導(dǎo)與抑制的啟動(dòng)子分別對(duì)其下游和上游基因進(jìn)行調(diào)控，使丙二酰輔酶A 的積累量處于動(dòng)態(tài)平衡，提高了脂肪酸的產(chǎn)量[50]。另外，在利用木糖合成1,2,4?丁三醇的途徑中，木糖酸是一個(gè)毒性中間代謝物。利用酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PcadBA與LacI 轉(zhuǎn)錄因子形成一個(gè)“非門(mén)”調(diào)控木糖酸合成基因xdh 和xylC，木糖酸濃度的提高會(huì)誘導(dǎo)PcadBA，進(jìn)而抑制木糖酸合成基因的表達(dá)，形成反饋抑制[87]。研究者還挖掘到了木糖酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PyjhI，用其誘導(dǎo)表達(dá)木糖酸下游途徑的基因[88]，這兩種調(diào)節(jié)均降低了木糖酸的積累，提高了終產(chǎn)物的產(chǎn)量。

在阿魏酸轉(zhuǎn)化香草醛的途徑中，用香草醛誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制香草醛的合成基因，使其在發(fā)酵前期香草醛合成速率慢，隨著香草醛量的增加，不斷誘導(dǎo)香草醛的合成。這種方法使細(xì)胞在發(fā)酵前期避免香草醛的毒性，積累更高的生物量，而在發(fā)酵后期香草醛產(chǎn)量更高[52]。通過(guò)群體感應(yīng)誘導(dǎo)系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵前期積累生物量、發(fā)酵后期誘導(dǎo)產(chǎn)物高效合成的效果[89?90]。

另一方面是對(duì)競(jìng)爭(zhēng)途徑的自主動(dòng)態(tài)調(diào)控。FPP是生產(chǎn)各種萜類物質(zhì)的重要前體，在釀酒酵母中很大一部分的FPP 都被用于合成麥角固醇，用于維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，但這與目標(biāo)途徑形成了競(jìng)爭(zhēng)。完全敲除FPP 轉(zhuǎn)化麥角固醇的基因ERG9 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)，因此一般都會(huì)考慮抑制ERG9 的轉(zhuǎn)錄水平。研究發(fā)現(xiàn)麥角固醇會(huì)對(duì)合成它的基因的啟動(dòng)子PERG1形成反饋抑制，因此可以用PERG1調(diào)控ERG9，使麥角固醇合成途徑處于反饋調(diào)節(jié)的狀態(tài)，這就減少了FPP 向麥角固醇的合成，使紫穗槐二烯的產(chǎn)量明顯提高，并且同時(shí)維持菌株良好的生長(zhǎng)[圖5(b）][91]。

3.2.2 自主動(dòng)態(tài)調(diào)控在提高細(xì)胞魯棒性中的應(yīng)用乙酸是對(duì)細(xì)胞毒性較強(qiáng)的代謝物之一，在乙酸合成過(guò)量的情況下需要抑制乙酸的合成途徑。研究者利用乙酸誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PglnAP2s、葡萄糖誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PgluA7以及溶氧抑制的啟動(dòng)子PfnrF8構(gòu)建了多種邏輯門(mén)，由于發(fā)酵過(guò)程中乙酸濃度、葡萄糖濃度和溶氧濃度均隨時(shí)間變化，因此通過(guò)多種邏輯門(mén)可得到一系列不同的動(dòng)態(tài)輸出信號(hào)。根據(jù)發(fā)酵中后期抑制乙酸合成的要求，選擇適當(dāng)?shù)倪壿嬮T(mén)對(duì)乙酸合成基因進(jìn)行了動(dòng)態(tài)抑制，極大地降低了乙酸在細(xì)胞內(nèi)的含量[46]。

熱激蛋白起到防止蛋白質(zhì)在高溫下錯(cuò)誤折疊或聚集的作用，而且不同的熱激蛋白對(duì)不同溫度下蛋白質(zhì)的保護(hù)作用也是不同的。利用響應(yīng)不同溫度的RNA 溫度計(jì)來(lái)調(diào)節(jié)不同熱激蛋白的過(guò)表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)熱激蛋白的梯級(jí)表達(dá)，降低細(xì)胞的表達(dá)負(fù)擔(dān)。另外，利用群體感應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控自殺基因，可使細(xì)胞維持在一定的數(shù)量，防止細(xì)胞濃度過(guò)高導(dǎo)致產(chǎn)熱效應(yīng)和過(guò)早進(jìn)入衰亡期[62]。

在細(xì)胞工廠中，異源表達(dá)往往對(duì)底盤(pán)細(xì)胞形成負(fù)擔(dān)，使細(xì)胞生長(zhǎng)水平降低。研究者在大腸桿菌中分析了表達(dá)異源基因?qū)?xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，發(fā)現(xiàn)表達(dá)異源基因使大部分熱激蛋白基因顯著上調(diào)。據(jù)此構(gòu)建了通過(guò)CRISPRi 自主調(diào)節(jié)細(xì)胞負(fù)擔(dān)的系統(tǒng)，用上調(diào)最為顯著基因的啟動(dòng)子PhtpG1控制靶向異源基因的gRNA，用組成型啟動(dòng)子表達(dá)dCas9，當(dāng)異源基因表達(dá)過(guò)高時(shí)，gRNA 的表達(dá)也會(huì)提高，進(jìn)而反饋抑制異源基因的表達(dá)，使細(xì)胞的生長(zhǎng)和生產(chǎn)處于平衡狀態(tài)，提高產(chǎn)物的產(chǎn)量[圖5（c）][92]。利用轉(zhuǎn)錄組挖掘到的高溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子和乙酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子分別對(duì)釀酒酵母谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)和乙酸降解途徑進(jìn)行強(qiáng)化，使ROS 和乙酸可以對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行自主的反饋調(diào)節(jié)，不但提高了細(xì)胞魯棒性和乙醇產(chǎn)量，還可以降低過(guò)表達(dá)造成的負(fù)擔(dān)[圖5（d）][57]。

圖5 自主動(dòng)態(tài)調(diào)控策略(a)FPP反饋抑制與反饋誘導(dǎo)提高紫穗槐二烯產(chǎn)量[56];(b)麥角固醇反饋抑制降低競(jìng)爭(zhēng)途徑通量[91];(c)轉(zhuǎn)錄負(fù)擔(dān)誘導(dǎo)的CRISPRi反饋調(diào)節(jié)[92];(d)脅迫誘導(dǎo)的抗脅迫反饋調(diào)節(jié)[57];(e)二次酸感應(yīng)細(xì)胞死亡系統(tǒng)[93]Fig.5 Autonomous dynamic regulations(a)FPP feedback inhibition and induction increase amorphadiene production[56];(b)ergosterol feedback inhibition decreases competitive pathway flux[91];(c)burden induced CRISPRi feedback regulation[92];(d)stress?driven feedback regulation of anti?stress system[57];(e)two count pH sensitive kill switch[93]

研究者構(gòu)建了一個(gè)酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡系統(tǒng)。用酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子Pasr調(diào)控毒蛋白Doc 的表達(dá)。通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的優(yōu)化使得細(xì)胞在pH7.0 穩(wěn)定生長(zhǎng)，而在pH5.0 時(shí)停止生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)復(fù)雜的基因線路實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在二次酸性下死亡的過(guò)程，基因線路包括觸發(fā)線路和效應(yīng)線路[圖5（e）]。在初始的中性pH 環(huán)境中，cI抑制啟動(dòng)子PR和PRM；當(dāng)菌株處于酸性脅迫下，誘導(dǎo)cro的表達(dá)，高濃度的cro可同時(shí)抑制PRM和PR，當(dāng)pH 恢復(fù)到中性時(shí)，低濃度的cro 只抑制PRM，PR開(kāi)啟xis 和int 的表達(dá)。Xis?Int 可將attL和attR 之間的序列切除；在第二次酸誘導(dǎo)下，doc 可以表達(dá)，并抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[93]。將致死基因doc替換為熒光蛋白基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)酸脅迫的計(jì)數(shù)[93]。

3.2.3 自絮凝實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離的智能化 在釀酒酵母及運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）等菌株中都存在細(xì)胞絮凝機(jī)制，在發(fā)酵后期開(kāi)啟細(xì)胞絮凝，可使細(xì)胞與發(fā)酵液自動(dòng)分離，簡(jiǎn)化分離過(guò)程，降低生產(chǎn)成本[94]。在釀酒酵母中，用高溫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PHSP30或乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PTPS1強(qiáng)化絮凝基因FLO1/5/11 的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞在發(fā)酵后期隨著溫度或乙醇濃度的升高自動(dòng)絮凝[95?96]。

坎帕尼亞鹽單胞菌（Halomonas campaniensis）的耐鹽和耐堿性使其非常有望被用于工業(yè)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵廢水的循環(huán)使用及開(kāi)放的發(fā)酵模式。通過(guò)敲除電子傳遞鏈中的基因etf，提高細(xì)胞表面的疏水性，使細(xì)胞實(shí)現(xiàn)自絮凝過(guò)程，不僅實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵廢液的多次循環(huán)使用，還提高了發(fā)酵產(chǎn)物聚?3?羥基丁酸酯（poly?3?hydroxybutyrate，PHB）的產(chǎn)量[97]。

4 菌株的智能進(jìn)化

除了理性地構(gòu)建智能調(diào)控菌株以外，菌株進(jìn)化過(guò)程的智能化也越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)。智能進(jìn)化可以分為基于生物傳感器的自主進(jìn)化和基于高通量突變體庫(kù)的智能進(jìn)化，前者相較于后者更加智能、更具針對(duì)性。以下將介紹一些經(jīng)典的智能進(jìn)化方法。

4.1 智能自主進(jìn)化提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量

基于生物傳感器的自主進(jìn)化一般要求生物傳感器的特異性較強(qiáng)，避免結(jié)構(gòu)類似物對(duì)生物傳感器和進(jìn)化過(guò)程造成干擾。為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，研究者發(fā)明了反饋調(diào)節(jié)的菌株進(jìn)化系統(tǒng)（feedback?regulated evolution of phenotype，F(xiàn)REP）[53]。系 統(tǒng) 包括三個(gè)模塊：①能夠與產(chǎn)物結(jié)合并改變與啟動(dòng)子結(jié)合力的轉(zhuǎn)錄因子；②轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的啟動(dòng)子；③誘變基因dnaQ。當(dāng)產(chǎn)物濃度低時(shí)，無(wú)產(chǎn)物結(jié)合在轉(zhuǎn)錄因子上，啟動(dòng)子開(kāi)啟誘變基因表達(dá)，使基因組進(jìn)行隨機(jī)突變，基因組的突變可獲得高產(chǎn)菌株，高產(chǎn)菌株中產(chǎn)物與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，從而抑制啟動(dòng)子，停止誘變基因的繼續(xù)表達(dá)。研究者在大腸桿菌中用酪氨酸結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子TyrR調(diào)節(jié)啟動(dòng)子ParoF的開(kāi)關(guān)，得到了高產(chǎn)酪氨酸的突變株[圖6（a）][53]。用前文所述的IPP 響應(yīng)元件控制誘變基因的表達(dá)，篩選得到了高產(chǎn)IPP和番茄紅素的菌株[53]。

4.2 智能自主進(jìn)化提高菌株魯棒性

研究者在枯草芽孢桿菌中開(kāi)發(fā)了一種自主進(jìn)化 系 統(tǒng)（autonomous evolution mutation system，AEMS），成功提高了菌株耐受乙偶姻的水平。將群體感應(yīng)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子PsrfA與木糖誘導(dǎo)系統(tǒng)組合成“與門(mén)”開(kāi)關(guān)，用其控制ssbA、bstG（誘變基因）和sspB（識(shí)別ssrA 標(biāo)簽并降解此標(biāo)記蛋白）。另一條基因線路中用IPTG 誘導(dǎo)系統(tǒng)控制融合ssrA 標(biāo)簽的mutL和alkA（編碼高保真修復(fù)酶）。在自主進(jìn)化的開(kāi)始加入IPTG 和木糖，高保真修復(fù)酶表達(dá)，使細(xì)胞正常生長(zhǎng)到一定密度，之后高密度誘導(dǎo)誘變基因表達(dá)，并降解高保真修復(fù)酶，使基因組突變[圖6（b）]。在高濃度乙偶姻下篩選得到耐受菌株[39]。此方法實(shí)現(xiàn)了菌株自發(fā)的突變，不需要控制外部條件，避免了傳統(tǒng)誘變致死率高、效率低等問(wèn)題。

類似地，研究者利用前文所述的pH 調(diào)節(jié)的核糖體開(kāi)關(guān)PRE 也實(shí)現(xiàn)了菌株的自主進(jìn)化，提高了菌株在酸性條件下的魯棒性。用PRE 調(diào)控基因int2（編碼一個(gè)整合酶使attB 和attP 之間的序列翻轉(zhuǎn)）的表達(dá)，在attB 和attP 之間插入一個(gè)組成型啟動(dòng)子，而在attB 和attP 兩側(cè)分別是誘變基因ednaQ 和熒光蛋白基因rfp。當(dāng)細(xì)胞處于酸性環(huán)境時(shí)，PRE 處于關(guān)閉狀態(tài)，ednaQ 表達(dá)并引起基因組突變，當(dāng)突變株獲得了抵抗酸性的能力時(shí)，細(xì)胞質(zhì)的pH 上升，使PRE 開(kāi)啟int2 的表達(dá)，從而使啟動(dòng)子方向發(fā)生改變，開(kāi)啟rfp 的表達(dá)[圖6（c）]。通過(guò)挑選帶有紅色熒光的菌落，即可得到耐酸的菌株[73]。

4.3 基于高通量突變體庫(kù)的智能進(jìn)化

研究者發(fā)明了一種在體內(nèi)合成CRISPR RNA（crRNA）文庫(kù)的方法（CRISPR adaptation?mediated library manufacturing，CALM）。利用產(chǎn)膿鏈球菌Streptococcus pyogenes 自身的CRISPR 防御機(jī)制，將合成crRNA 的基因元件移植到其他菌株中，其中包括間隔重復(fù)序列，反義crRNA 以及Cas 蛋白基因hdcas9、cas1、cas2和csn2[98]。將目標(biāo)基因組的碎片轉(zhuǎn)化到此工程菌中，可使工程菌自動(dòng)獲得crRNA 文庫(kù)，測(cè)序表明文庫(kù)覆蓋了約95%可靶向的位置。用此方法篩選得到耐受氨基糖苷類抗生素的菌株[99]。

圖6 基于生物傳感器的智能自主進(jìn)化策略(a)FREP[53];(b)AEMS[39];(c)利用pH感應(yīng)的核糖體開(kāi)關(guān)的自主進(jìn)化[73]Fig.6 Intelligent autonomous evolutions(a)FREP[53];(b)AEMS[39];(c)autonomous evolution based on pH?sensitive riboswitch[73]

人工合成酵母基因組（Sc2.0）通過(guò)在基因的3′UTR 處插入loxPsym 序列使得人工合成的基因組容易 編 輯 與 進(jìn) 化[100?102]。 SCRaMbLE（synthetic chromosome rearrangement and modification by loxP?mediated evolution）就是通過(guò)重組酶Cre 的介導(dǎo)使兩個(gè)loxPsym 之間的序列發(fā)生刪除、倒置或翻倍等事件（圖7）。通過(guò)用半乳糖和β?雌二醇構(gòu)成的“與門(mén)”開(kāi)關(guān)提高Cre 表達(dá)的嚴(yán)謹(jǐn)性，使得SCRaMbLE 能夠被精確控制[103]。另外，光控誘導(dǎo)Cre 重組酶的表達(dá)可以使誘導(dǎo)更嚴(yán)謹(jǐn)、強(qiáng)度更高、開(kāi)關(guān)更可控[104]。研究者在SCRaMbLE 處理后篩選到耐堿性的菌株[105]。通過(guò)將合成型染色體酵母與其他單倍體酵母雜交形成雜合二倍體，再進(jìn)行SCRaMbLE，可以更快速和高效地篩選得到耐高溫和耐咖啡因的菌株，這種方法降低了SCRaMbLE的致死率[106]。研究者開(kāi)發(fā)了反向雙篩選標(biāo)記的SCRaMbLE 系統(tǒng)ReSCuES（reporter of SCRaMbLEd cells using efficient selection），這種方法避免了假陽(yáng)性菌落的出現(xiàn)，通過(guò)此方法篩選得到耐受乙醇、耐受高溫以及耐受乙酸的菌株[107]。SCRaMbLE 同樣可以應(yīng)用于生產(chǎn)異源天然產(chǎn)物中，可以將外源途徑的基因線路通過(guò)質(zhì)粒[108?109]或基因組整合[103,110?111]的方式構(gòu)建到合成型染色體酵母中，開(kāi)啟SCRaMbLE 后篩選高產(chǎn)菌株，并測(cè)序研究合成型染色體基因型的變化與表型的關(guān)系。目前通過(guò)SCRaMbLE 已成功提高了β?胡蘿卜素、紫色桿菌素及樺木酸的產(chǎn)量。進(jìn)一步，研究者還開(kāi)發(fā)了SCRaMbLE?in 的策略，即在體外首先構(gòu)建好代謝途徑的文庫(kù)，再通過(guò)轉(zhuǎn)化和SCRaMbLE 同時(shí)進(jìn)行使基因線路文庫(kù)整合到合成型染色體上，實(shí)現(xiàn)外源基因線路與合成型染色體的共同進(jìn)化，此方法比整合到基因組單拷貝位點(diǎn)的產(chǎn)量提高了2～10倍[112]。

圖7 SCRaMbLE作用原理Fig.7 Mechanism of SCRaMbLE

5 發(fā)酵過(guò)程的智能化

發(fā)酵過(guò)程的智能化主要體現(xiàn)在發(fā)酵工廠的在線控制和實(shí)驗(yàn)室研究中的微流控兩方面。

5.1 發(fā)酵控制的智能化

發(fā)酵過(guò)程中的數(shù)據(jù)采集和自動(dòng)化控制是決定其智能程度的關(guān)鍵（圖8）。通過(guò)越來(lái)越多的在線傳感器的開(kāi)發(fā)，計(jì)算機(jī)可以獲得更多的發(fā)酵過(guò)程參數(shù)，并利用大數(shù)據(jù)分析來(lái)更好地控制發(fā)酵條件。除了常規(guī)的發(fā)酵參數(shù)，近年來(lái)還開(kāi)發(fā)了能夠檢測(cè)發(fā)酵尾氣（氧氣和二氧化碳等）、活細(xì)胞數(shù)量、小分子代謝物等參數(shù)的在線傳感器[113]。通過(guò)多尺度、在線的參數(shù)檢測(cè)和控制，可以提高產(chǎn)物在中試以及工業(yè)級(jí)規(guī)模發(fā)酵罐中的產(chǎn)量[114?115]。

工業(yè)發(fā)酵罐中控制參數(shù)的不均一性和時(shí)變性給發(fā)酵控制增加了難度，并且細(xì)胞未處于發(fā)酵最佳條件嚴(yán)重降低了發(fā)酵產(chǎn)量。通過(guò)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的在線自學(xué)習(xí)的溫度控制方法，可以提高發(fā)酵罐中溫度控制的精確程度，并且使多段溫度控制更加穩(wěn)定[116]。發(fā)酵過(guò)程的補(bǔ)料策略同樣影響發(fā)酵產(chǎn)量，例如，如何添加甘油使1,3?丙二醇的產(chǎn)量最大化，研究者通過(guò)將蒙特卡羅抽樣與路徑積分相結(jié)合的改進(jìn)粒子群算法來(lái)優(yōu)化控制方法，提高了產(chǎn)物的濃度[117]。

5.2 微流控技術(shù)

近年來(lái)，微流控技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以及高通量篩選和高通量測(cè)序，具有可控性強(qiáng)、自動(dòng)化和通量高的特點(diǎn)。目前能夠?qū)崿F(xiàn)利用全自動(dòng)的微流控操作平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞的篩選和檢測(cè)[118?119]。微流控技術(shù)與單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)相結(jié)合[120?121]不僅提高了測(cè)序通量，而且可以解決微生物培養(yǎng)中的細(xì)胞分化、混菌互作關(guān)系等難以解決的科學(xué)問(wèn)題。

6 結(jié)論與展望

智能化的生物制造逐漸地受到人們的關(guān)注，其對(duì)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程將起到革命性的作用。本文從蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)、生物傳感器、基因線路、菌株進(jìn)化和發(fā)酵過(guò)程五個(gè)層面對(duì)智能生物制造進(jìn)行了介紹和解析。在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的智能化層面，調(diào)節(jié)蛋白的設(shè)計(jì)取得了一些重要突破，獲得了大量調(diào)節(jié)蛋白用于細(xì)胞調(diào)控。而要想實(shí)現(xiàn)任意功能的酶的從頭設(shè)計(jì)這一終極目標(biāo)，繼續(xù)發(fā)展計(jì)算機(jī)的智能設(shè)計(jì)方法將是必經(jīng)之路。對(duì)酶的催化選擇性、條件選擇性機(jī)制的解析可以幫助人們更深入地理解酶分子設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)酶的智能設(shè)計(jì)。在生物傳感器的智能化層面，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種響應(yīng)不同信號(hào)的生物傳感器，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯調(diào)節(jié)相關(guān)的以及蛋白質(zhì)類的生物傳感器。生物傳感器的穩(wěn)定性、嚴(yán)謹(jǐn)性、靈敏度、檢測(cè)范圍等指標(biāo)是評(píng)價(jià)其能否被應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中的重要標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)生物傳感器響應(yīng)信號(hào)的拓展以及性能的優(yōu)化將是實(shí)現(xiàn)智能生物制造過(guò)程的重要基礎(chǔ)。在代謝調(diào)控的智能化層面，細(xì)胞完全自主的動(dòng)態(tài)調(diào)控優(yōu)于傳統(tǒng)的動(dòng)態(tài)調(diào)控方式。在各種生物傳感器的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝途徑或魯棒性的自主調(diào)節(jié)，將對(duì)降低發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)量起到重要作用。在菌株的智能進(jìn)化層面，基于生物傳感器的自主進(jìn)化一般要求生物傳感器的特異性較強(qiáng)，避免結(jié)構(gòu)類似物對(duì)生物傳感器和進(jìn)化過(guò)程造成干擾。因此，開(kāi)發(fā)重要產(chǎn)物的生物傳感器是至關(guān)重要的。另外，借助智能化高通量的機(jī)器人，煩瑣的高重復(fù)度的生化實(shí)驗(yàn)將逐漸被智能化機(jī)器人取代。高通量組裝與篩選平臺(tái)已越來(lái)越多地被應(yīng)用[22,122]，并且高通量的化合物檢測(cè)平臺(tái)[111]的應(yīng)用也是替代生物傳感器的一種方案，并且更具普適性。在發(fā)酵過(guò)程的智能化層面，工業(yè)級(jí)發(fā)酵的多參數(shù)在線傳感器、大數(shù)據(jù)分析和優(yōu)化控制方法，以及實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下微流控發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展將是未來(lái)智能發(fā)酵過(guò)程的發(fā)展方向。

圖8 發(fā)酵工廠的智能化Fig.8 Intelligence of fermentation control