司少艷 朱曉瓞 宋淑軍 吳瑩瑩 秦亞亞 岳茂興

核能與核技術在給人類帶來益處的同時,核輻射也對人類健康構成極大的威脅。核輻射產(chǎn)生的電離輻射可通過氧化應激機制,造成人和動物多個系統(tǒng)器官損傷和功能障礙,其中造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)是最為敏感的系統(tǒng)。造血系統(tǒng)輻射損傷的主要遠期效應之一就是造血衰老、骨髓抑制。而免疫系統(tǒng)是抵御病原微生物入侵以及抗腫瘤的第一道防線,對于維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和人體的健康非常重要。免疫系統(tǒng)的損傷則導致機體對微生物的易感性增加,以及患腫瘤的風險增加。因此,尋找輻射損傷后恢復造血功能和免疫功能的有效方法,對輻射損傷救治有重要意義。研究顯示:維生素B6和多種氨基酸具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[1-9]。本研究中，筆者觀察了維生素B6和豐諾安(20AA復方氨基酸)對電離輻射引起的造血和免疫損傷的保護作用。

材料和方法

一、材料

不同熒光素標記的抗小鼠抗體包括PerCP-CD3、FITC-CD4、PE-NK1.1、APC-CD19、PE-CD25、APC-FoxP3抗體,Fixation/Permeabilization Concentrate、Fixation/Permeabilization Diluent、10×Permeabilization Buffer均為美國eBioscience公司產(chǎn)品;10×紅細胞裂解液為美國Biolengend公司產(chǎn)品;維生素B6氯化鈉注射液為石家莊四藥有限公司生產(chǎn),維生素B6含量為每250 mL含2.5 g;豐諾安(20AA復方氨基酸注射液)為辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn);健康6～8周齡雌性ICR小鼠,購自北京大學醫(yī)學部實驗動物醫(yī)學研究中心。

二、小鼠X線照射模型及給藥處理

(一)X線照射小鼠模型

將小鼠裝入特制的有機玻璃盒中,采用AXESSE醫(yī)用直線加速器進行一次性X線照射,主要技術參數(shù):采用6MVX線,源軸距(source axis distance,SAD)為101.5 cm,劑量率600 cGy/min,照射劑量為3 Gy,照射野為30 cm×30 cm。

(二)小鼠分組及給藥方案

將 ICR小鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、模型組、維生素B6組、豐諾安組和聯(lián)合組,每組7只。除對照組外,其余4組小鼠均接受X線照射。從照射前4 d開始至照射后的第10天,1次/d腹腔注射給藥：維生素B6組小鼠注射0.3 mL用等滲鹽水1∶2稀釋的維生素B6氯化鈉注射液,豐諾安組小鼠注射0.3 mL用等滲鹽水1∶2稀釋的豐諾安(20AA復方氨基酸注射液),聯(lián)合組小鼠注射0.15 mL維生素B6氯化鈉注射液+0.15 mL豐諾安(20AA復方氨基酸注射液)的混合液,對照組和模型組小鼠腹腔注射0.3 mL等滲鹽水。照射后的第11天,小鼠稱量體重,摘眼球取血,乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)抗凝,用于以下指標的檢測。

三、觀察指標

(一)自細胞分類計數(shù)

采用全自動血球計數(shù)儀對小鼠外周血自細胞進行分類計數(shù)。

(二)淋巴細胞亞群分析

取100 μl EDTA抗凝血,分別加入PerCP-CD3、FITC-CD4、APC-CD19和PE-NK1.1抗體用于檢測總T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和自然殺傷(natural killer cell,NK)細胞,分別室溫避光培養(yǎng)30 min后,加2 mL紅細胞裂解液溶解紅細胞;磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗2遍后,加入20 g/L多聚甲醛溶液0.3 mL;流式細胞儀分析總T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和NK細胞在淋巴細胞中的百分比,然后根據(jù)血常規(guī)淋巴細胞濃度,計算相應淋巴細胞亞群在外周血中的濃度。

取100 μl EDTA抗凝血,加入FITC-CD4、PE-CD25抗體,室溫避光30 min;加入1 mL破膜液,4℃避光30 min;用1×緩沖液洗滌2次后,加入APC-FoxP3,4℃避光30 min;用1×緩沖液洗滌2次后,加300 μl PBS;流式細胞儀分析Treg細胞在淋巴細胞中的百分比,然后根據(jù)血常規(guī)淋巴細胞濃度,計算Treg細胞亞群在外周血中的濃度。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、維生素B6和(或)豐諾安對X線照射小鼠血常規(guī)的影響

與對照組相比,模型組小鼠外周血白細胞總數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、紅細胞、血小板數(shù)量和血紅蛋白濃度均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,維生素B6組、豐諾安組和聯(lián)合組小鼠白細胞總數(shù)和血小板數(shù)量顯著升高(P<0.05),血紅蛋白濃度雖有所回升,但仍均低于對照組(P<0.05);維生素B6組和聯(lián)合組小鼠淋巴細胞數(shù)量顯著升高(P<0.05),維生素B6組小鼠淋巴細胞數(shù)量仍顯著低于對照組(P<0.05),而聯(lián)合組小鼠淋巴細胞數(shù)量與對照組無顯著差異(P>0.05)。與聯(lián)合組相比,維生素B6組小鼠中性粒細胞百分比和單核細胞數(shù)量高于聯(lián)合組,淋巴細胞百分比高于聯(lián)合組(P<0.05);豐諾安組小鼠白細胞總數(shù)、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量低于聯(lián)合組(P<0.05)。見表1。

表1 維生素B6和(或)豐諾安對X線照射小鼠血常規(guī)的影響

二、維生素B6和(或)豐諾安對X線照射小鼠淋巴細胞亞群的影響

與對照組相比,模型組小鼠外周血NK細胞、總T細胞、CD4+和CD8+T細胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05),B細胞和Treg細胞數(shù)量無明顯變化(P>0.05);與模型組相比,維生素B6組、豐諾安組和聯(lián)合組小鼠上述指標均顯著回升(P<0.05),但總T細胞、CD4+和CD8+T細胞數(shù)量仍顯著低于對照組(P<0.05);同時維生素B6組和聯(lián)合組小鼠外周血B細胞數(shù)量顯著高于對照組和模型組(P<0.05);與聯(lián)合組相比,豐諾安組小鼠NK細胞數(shù)量和總T細胞和CD4+T細胞數(shù)量均低于聯(lián)合組(P<0.05)。與對照組相比,模型組、維生素B6組、豐諾安組和聯(lián)合組小鼠外周血總T細胞、CD4+和CD8+T細胞百分比均顯著降低(P<0.05),B細胞、Treg細胞百分比和CD4/CD8比值均顯著升高(P<0.05),豐諾安組和聯(lián)合組小鼠NK細胞百分比顯著升高;與模型組相比,聯(lián)合組小鼠NK細胞百分比顯著升高(P<0.05),B細胞和Treg細胞百分比顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1～3。

表2 維生素B6和(或)豐諾安對X線照射小鼠淋巴細胞亞群百分比和CD4/CD8比值的影響

圖1 淋巴細胞亞群占淋巴細胞百分比流式分析圖

圖2 Treg細胞占淋巴細胞百分比流式分析圖

圖3 維生素B6和(或)豐諾安對X線照射小鼠淋巴細胞亞群數(shù)量的影響

討 論

豐諾安是由20AA復方氨基酸注射液組合而成的氨基酸溶液。氨基酸除了提供營養(yǎng)、參與蛋白合成,轉(zhuǎn)化為糖或脂肪進入三羧酸循環(huán)進而發(fā)揮供能作用外,近年來的研究顯示,某些氨基酸具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用。研究證明,精氨酸(arginine,Arg)可促進淋巴細胞增殖及細胞因子生成,基礎飼糧中添加Arg可誘導白細胞及細胞因子的產(chǎn)生來增強仔豬的細胞免疫和體液免疫功能[1-2]。甘氨酸(glycine,Gly)為自然界中結構最簡單的氨基酸,除了參與蛋白質(zhì)及代謝性生理分子的合成,還具有抗氧化應激及免疫調(diào)節(jié)作用[3]。谷氨酸胺(glutamine,Gln)是人和動物體內(nèi)含量最豐富的游離氨基酸,可增加巨噬細胞和淋巴細胞的分化,促進免疫細胞因子的產(chǎn)生[4],有效提高黏膜中免疫球蛋白A(immunoglobulin A,IgA)的產(chǎn)生及T淋巴細胞、輔助性T細胞(helper cells,Th)及細胞毒性T細胞(cyto-toxic T cells,Tc)的數(shù)量[5],對調(diào)節(jié)腸道免疫功能有重要作用。而含硫氨基酸的抗氧化保護作用可以通過其自身的抗氧化作用,以及合成具有重要抗氧化作用的物質(zhì)(谷胱甘肽)2種途徑實現(xiàn)[6]。研究顯示[15]:連續(xù)給予大鼠氨基酸復合劑60 d,具有降低血清、肝組織中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的作用;同時具有升高血清、肝組織中只超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力的作用,表明氨基酸復合劑具有抗氧化作用。陳勇等[16]研究發(fā)現(xiàn):胃癌患者根治術預防性應用復方氨基酸注射液,能夠減緩蛋白消耗、改善營養(yǎng)狀況,提高機體免疫功能,降低患者的術后感染。岳茂興等[17-18]對維生素B6聯(lián)用豐諾安新療法的研究表明:豐諾安所含有的氨基酸譜與人體血液成分相近,可以安全高效地為人體提供種類最豐富、最全面,同時具有強勁動能的游離氨基酸,易被人體所利用,具有改善肝功能、迅速保護支持重要器官的功能。

維生素B6是在代謝和功能上相關的一類吡哆醇的總稱,包括吡哆醛(PL),吡哆醇(PN)和吡哆胺(PM),是動物體內(nèi)重要的營養(yǎng)素,也是機體中的100多種與轉(zhuǎn)氨、脫硫及脫羧反應有關的酶以及人體內(nèi)約140種酶的輔酶,參與催化80多種生化反應在人體蛋白質(zhì)代謝、糖原分解為葡萄糖及脂類代謝中具有不可替代的作用。它在促進機體生命新陳代謝中起到十分重要的作用[19-20]。研究顯示[7]：在核酸和蛋白質(zhì)代謝中維生素B6參與了抗氧化反應和DNA 和信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)的合成,在免疫應答過程中維生素B6參與了細胞免疫、體液免疫,其缺乏會導致淋巴器官的萎縮,細胞免疫功能降低,淋巴細胞生成的減少,白細胞介素-2的生成和抗體反應發(fā)生改變[8-9]。岳茂興等[21-24]的長期臨床與基礎研究證實:豐諾安與維生素B6合用具有促進機體止血、利尿、解毒、保護大腦及神經(jīng)系統(tǒng)功能、改善肝功能、減輕肺損傷、提高機體免疫功能、凝血功能和營養(yǎng)狀況的功效。能為急危疑難重癥患者贏得關鍵性的綜合治療時間,從而逆轉(zhuǎn)疑難危重病患者的病情。并且維生素B6在人體內(nèi)的半衰期比較短,能被較快地排出體外。因此用藥安全,一般不會對患者產(chǎn)生嚴重毒副作用。自2008年廣泛應用以來,已在全國多家醫(yī)院推廣應用,未發(fā)生一例過量事件。且長期使用安全、療效確切、副作用小,能滿足急危疑難危重癥患者治療需要。

由于氨基酸和維生素B6具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用,因此筆者初步觀察了豐諾安和維生素B6是否能夠改善電離輻射對造血和免疫系統(tǒng)的損傷。結果顯示:豐諾安、維生素B6、維生素B6與豐諾安的復合液均可以提高X線照射小鼠的白細胞總數(shù)、淋巴細胞、NK細胞、B細胞、總T細胞、CD4+和CD8+T細胞、血小板的數(shù)量;聯(lián)合組(維生素B6聯(lián)用豐諾安)在提高總T細胞數(shù)量和CD4+T細胞數(shù)量效果上優(yōu)于維生素B6,在提高白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)量效果上優(yōu)于豐諾安組,提示豐諾安和維生素B6聯(lián)合應用效果優(yōu)于單一應用。豐諾安和維生素B6對外周血細胞的保護作用的具體機制可能與氨基酸和維生素B6的抗氧化,以及免疫調(diào)節(jié)作用有關,有待進一步深入研究。