楊 瓊，潘 婭，陳 粲，戴桃李

(1. 貴州民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，貴陽(yáng) 550025; 3. 廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心，廣東 廣州 510632)

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指腦血管疾病引起腦組織損害而產(chǎn)生的智能障礙綜合征，表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降、記憶力減退及情感障礙等，它是常見(jiàn)的老年癡呆類(lèi)型[1]。阿尼西坦(aniracetam，Ani)是腦功能改善藥，主要成分是1-2-吡咯烷酮，臨床用于治療兒童腦功能發(fā)育遲緩者、中老年及腦血管病后的記憶力損害等[2，3]。半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-3)作為Caspase 家族中的一員，是凋亡的關(guān)鍵酶，它能使細(xì)胞凋亡精確、完整地實(shí)施[4]。海馬腦區(qū)與機(jī)體的認(rèn)知、情感密切相關(guān)，其神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡，可引起情感及學(xué)習(xí)記憶功能障礙而導(dǎo)致VD[5]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用Ani灌胃治療VD模型大鼠，檢測(cè)其海馬齒狀回Caspase-3表達(dá)水平，來(lái)探討阿尼西坦治療VD的可能機(jī)制，以期為臨床提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

4個(gè)月齡左右的雄性(避免雌激素影響)Wistar鼠45只，體重(270±15)g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXY(黔) 2013-0001，普通飼養(yǎng)。阿尼西坦膠囊由無(wú)錫凱西藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。Morris水迷宮由上海軟隆科技發(fā)展有限公司提供。Caspase-3試劑盒購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理

大鼠隨機(jī)分成3組(n=15)：對(duì)照組(Control組)、模型組(Modle組)和阿尼西坦治療組(Ani組)。模型組、Ani組大鼠采用改良四血管阻斷(four vessel occlusion，4-VO)法建立VD模型[6]：頸部后方正中手術(shù)暴露第二頸椎，用電烙鐵尖端燒灼第二頸椎橫突翼小孔，造成小孔下走行的雙側(cè)椎動(dòng)脈永久性閉塞；24 h后行頸部前方正中切口，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈并用動(dòng)脈夾夾閉3次，各次間隔1 h，每次持續(xù)5 min。模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)：夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈1 min內(nèi)，翻正反射消失，瞳孔散大，呼吸頻率變快，眼底變白[7]。不符合條件者淘汰，并另行補(bǔ)充成功的動(dòng)物模型。對(duì)照組大鼠手術(shù)同上，但不做燒灼椎動(dòng)脈、夾閉頸總動(dòng)脈等阻斷血供的操作。

Ani組大鼠造模后用Ani 300 mg/kg(蒸餾水配成2 ml)灌胃[6]，每天1次，共4周。對(duì)照組、模型組大鼠同時(shí)給予生理鹽水2 ml灌胃。

1.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

術(shù)后第4周進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)。水迷宮平均分為四個(gè)象限，站臺(tái)置于第Ⅲ象限的水面下(非可見(jiàn))。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一個(gè)星期，前6 d做定向航行實(shí)驗(yàn)(測(cè)空間學(xué)習(xí)能力)：將每只大鼠按順序(Ⅰ～Ⅳ象限)面向池壁單獨(dú)放入水中，記錄它60 s內(nèi)從入水點(diǎn)爬上站臺(tái)所需的時(shí)間，為逃避潛伏期，6天×4次/只。第7日行空間探索實(shí)驗(yàn)(測(cè)空間記憶能力)：拆去站臺(tái)，把大鼠從第Ⅰ象限放入水池，記錄它120 s內(nèi)穿越原站臺(tái)位置的次數(shù)和在第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)caspase表達(dá)

迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠麻醉、取腦、固定。經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋處理后，在海馬處行冠狀位連續(xù)切片，片厚4～5 μm。 Caspase-3染色嚴(yán)格按試劑盒上SABC方法進(jìn)行。每組取切片6張×5個(gè)高倍視野(隨機(jī))，進(jìn)行caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)；然后每幅圖像選取五個(gè)孤立、分離的細(xì)胞進(jìn)行平均光密度(average optical density，AOD)測(cè)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 阿尼西坦對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

2.1.1 定向航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)顯示Model組平均逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于Control組(P<0.01，表1)，且呈現(xiàn)越往后差距越大的趨勢(shì)，這表明VD模型大鼠找到站臺(tái)逃避危險(xiǎn)能力下降，即空間學(xué)習(xí)能力明顯受損。Ani組平均逃避潛伏期明顯短于Model組(P<0.05)，說(shuō)明Ani可明顯改善VD大鼠的學(xué)習(xí)能力。Ani組逃避潛伏期比Control組延長(zhǎng)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明治療后大鼠學(xué)習(xí)能力在一定程度上接近于正常組。

Tab. 1 Daily average escape latency of each n=15)

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)顯示Model組大鼠的空間記憶能力較Control組顯著降低(P<0.01，表2)；Ani組空間記憶能力較Model大鼠得到明顯改善(P<0.01)，但仍低于Control組(P<0.05)。這表明經(jīng)Ani治療后大鼠的空間記憶能力得到顯著改善，但仍低于正常水平。

Tab. 2 Swimming time in third quadrant and times of traversing platform in spatial probe test in n=15)

2.2 海馬齒狀回caspase-3表達(dá)

海馬齒狀回caspase-3陽(yáng)性計(jì)數(shù)、AOD值和細(xì)胞分布情況見(jiàn)表3和圖1?？梢钥闯?，Model組海馬齒狀回細(xì)胞排列紊亂、疏松，數(shù)目較Control組明顯減少，細(xì)胞內(nèi)caspase-3 陽(yáng)性表達(dá)顯著增多。Ani組海馬齒狀回細(xì)胞數(shù)目較模型組增多且排列緊密，細(xì)胞內(nèi)caspase-3 表達(dá)水平較之降低(陽(yáng)性數(shù)目減少、AOD值增高)。這表明Ani能降低caspase-3所引起的海馬細(xì)胞凋亡，即保護(hù)海馬腦區(qū)細(xì)胞免受缺血缺氧損傷(圖1見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ)。

Tab. 3 Counts of caspase-3 positive neurons in hippocampal dentate gyrus in n=15 )

3 討論

腦部血液供應(yīng)主要來(lái)自于兩大系統(tǒng)——頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)和椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)。當(dāng)中二者或任一出現(xiàn)慢性腦血管病(如動(dòng)脈粥樣硬化、血栓等)引起腦供血不足而導(dǎo)致腦細(xì)胞缺血缺氧死亡是引發(fā)VD 的主要原因[8]。本實(shí)驗(yàn)采用國(guó)際公認(rèn)的4-VO改良法建立VD動(dòng)物模型，較好地模擬VD的缺血/再灌注損傷機(jī)制[9]。

Morris水迷宮檢測(cè)顯示，模型大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力明顯低于對(duì)照組，表明本實(shí)驗(yàn)用4-VO法造模成功。VD大鼠經(jīng)Ani灌胃治療后，學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高(尤其空間學(xué)習(xí)功能)，這證實(shí)Ani確有保護(hù)腦功能的良好作用。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，也是缺血缺氧易損傷區(qū)[10]。血管性癡呆患者認(rèn)知功能障礙的一個(gè)重要原因就是由于腦缺血時(shí)海馬結(jié)構(gòu)中各功能亞區(qū)神經(jīng)元的丟失，這是此病形成的一個(gè)重要病理學(xué)基礎(chǔ)[11]，因此本實(shí)驗(yàn)選用海馬作為實(shí)驗(yàn)?zāi)X區(qū)。慢性腦缺血缺氧所致的腦細(xì)胞死亡以凋亡為主[12]。細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的程序性死亡過(guò)程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。Caspase家族是一組介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶，其中Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用[13]。當(dāng)機(jī)體缺血缺氧時(shí)，凋亡機(jī)制被級(jí)聯(lián)激活，即上游Caspase有序地激活下游，而下游終末執(zhí)行酶Caspase-3能降解多種胞內(nèi)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞固縮凋亡[14]。

本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到Ani干預(yù)后的VD大鼠海馬神經(jīng)元分布規(guī)則緊密，且細(xì)胞數(shù)目較模型組多，這可能與Ani減少Caspase-3表達(dá)、削弱各種促凋亡因子的作用而保護(hù)腦細(xì)胞有關(guān)。這可能是Ani改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為Ani臨床治療VD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。