盧林明，俞婷婷，何曉偉，湯 娟，李先偉△

(1．皖南醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002； 2．皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 蕪湖 241002； 3．皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種以成纖維細(xì)胞(或)肌成纖維細(xì)胞群異常擴(kuò)增、肺組織結(jié)構(gòu)重塑為特征的慢性進(jìn)行性疾病，其發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明[1]。其主要病理表現(xiàn)為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)表達(dá)上調(diào)、肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFb)增多及細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM)沉積增加，其中MFb的活化誘導(dǎo)的EMC加速沉積是導(dǎo)致肺纖維化的重要因素[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化時(shí)MFb可能來(lái)源于間質(zhì)細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial mesenchymal transition, EMT)和骨髓來(lái)源的循環(huán)纖維細(xì)胞，其中TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT是MFb的主要來(lái)源[3]。Gao[4]等人研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT與其上調(diào)真核翻譯起始因子3a(eukaryotic initiation factor 3a,eIF3a)有關(guān)。而我們前期研究也發(fā)現(xiàn)采用大劑量辣椒素(50 ml/kg)耗竭內(nèi)源性降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)能夠加重博萊霉素(bleomycin, BLM)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化[5]；而外源性CGRP通過(guò)抑制eIF3a的表達(dá)、上調(diào)p27的表達(dá)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制了MFb的增殖活化[6]。由此可見(jiàn)，調(diào)節(jié)內(nèi)源性CGRP的釋放在一定程度上能夠緩解肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

辣椒素(capsaicin, Cap)是從辣椒提取的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗纖維化等作用[7]。Xu等人研究發(fā)現(xiàn)Cap通過(guò)激動(dòng)瞬時(shí)電位感受器香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)抑制人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的的粘附、遷移和侵襲[8]。Qu[9]等人研究發(fā)現(xiàn)Cap通過(guò)激動(dòng)TRPV1受體，釋放擴(kuò)血管物質(zhì)P物質(zhì)而緩解野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓。而Li[10,11]等人研究發(fā)現(xiàn)Cap是通過(guò)激活TRPV1 而產(chǎn)生NO、CGRP 而產(chǎn)生心血管保護(hù)作用?；谝陨系难芯勘尘埃狙芯繑M探討小劑量Cap是否通過(guò)激動(dòng)TRPV1，促進(jìn)內(nèi)源性CGRP的釋放，抑制肺泡上皮細(xì)胞EMT而緩解BLM誘導(dǎo)的PF。從而為肺纖維化發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為研發(fā)治療肺纖維化的藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)8周年雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)(許可證號(hào)：SCXK(浙)2018-0012)。

1.2 藥物及試劑

辣椒素(capsaicin，Cap，美國(guó)MedChemExpress公司，產(chǎn)品編號(hào)HY-10448)。TRPV1受體阻斷劑SB-452533(美國(guó)SIGMA公司，產(chǎn)品編號(hào)SML0890)。博萊霉素注射液(日本化藥株式會(huì)社，產(chǎn)品編號(hào)970592)。改良 Masson 三色染色液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)S0075)。PrimeScriptTMRT reagent Kit(產(chǎn)品編號(hào)RR047A)和TB Green?Premix Ex TaqTMII(產(chǎn)品編號(hào)RR820A)購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。CGRP ELISA Kit(美國(guó)Cusabio 公司，產(chǎn)品編號(hào)Q99JA0)。兔抗小鼠TRPV1抗體(產(chǎn)品編號(hào)PAB16889)和兔抗小鼠eIF3a抗體(產(chǎn)品編號(hào)ABP58469)購(gòu)于武漢艾美捷科技有限公司。兔抗小鼠ERK1/2抗體(產(chǎn)品編號(hào)#4695)及兔抗小鼠磷酸化ERK1/2抗體(產(chǎn)品編號(hào)#8544)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。兔抗小鼠(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-10900R)、兔抗小鼠(alpha smooth muscle actin,α-SMA)抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-0189R)、小鼠抗小鼠I型膠原(collagen I)抗體(產(chǎn)品編號(hào)bsm-33400M)、兔抗小鼠III型膠原抗體(產(chǎn)品編號(hào)bs-0549R)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔抗小鼠波形蛋白(Vimentin，產(chǎn)品編號(hào)EPR3776)抗體、小鼠抗小鼠E鈣粘蛋白(E-Cadherin，產(chǎn)品編號(hào)M168)抗體、小鼠抗小鼠緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1，產(chǎn)品編號(hào)ab96587)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.3 肺纖維化模型的建立及分組

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)分為對(duì)照(Control, CON)組、博萊霉素(bleomycin, BLM)組、Cap (0.5、1、2 mg/kg)劑量組及Cap(2 mg/kg)+SB-452533 (2.5 mg/kg)劑量組，每組n=12。除CON組外，其余各組按3.5 mg/kg劑量氣管滴注博萊霉素制備肺纖維化模型。CON組除氣管滴注等量的生理鹽水外，其余造模方法與BLM組相同。Cap 各組及Cap+SB-452533組連續(xù)皮下注射給藥21 d，其中Cap+SB-452533組先給予SB-452533，60 min后再給予Cap。

1.4 ELISA法檢測(cè)血漿CGRP濃度

小鼠眼球摘除取血0.5 ml，放入1.5 ml離心管中(管中提前加入50 μl 10% Na2EDTA和50 μl抑肽酶)，5 000 r/min離心10 min收集血漿。按CGRP ELISA Kit說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿CGRP的OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算CGRP的濃度。

1.5 形態(tài)學(xué)分析

取小鼠左肺下葉，制成5 μm的石蠟切片。按HE染色步驟進(jìn)行染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.6 肺組織膠原變化分析

取小鼠左肺下葉，制成5 μm的石蠟切片。按Masson染色步驟進(jìn)行染色，膠原纖維被染成藍(lán)色，光鏡下觀察肺組織膠原變化。另外，采用石蠟切片，根據(jù)SABC免疫組化法步驟檢測(cè)肺組織collagen III蛋白表達(dá)，collagen III一抗?jié)舛葹?∶500，相應(yīng)二抗?jié)舛葹?∶500。肺組織collagen III陽(yáng)性表達(dá)呈黃至棕黃色顆粒。

1.7 基因表達(dá)分析

按PrimeScriptTMRT reagent Kit說(shuō)明書(shū)提取左肺上葉總RNA并將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后按照TB Green?Premix Ex TaqTMII試劑盒說(shuō)明書(shū)，以2 μl cDNA為模板，20 μl反應(yīng)體系，用StepOnePlusTMReal-Time PCR System進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件參照我們前期的研究結(jié)果[5]。以GAPDH為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)各組ΔΔCt值，計(jì)算相應(yīng)RQ值并進(jìn)行分析。引物列表如下(表1)。

1.8 蛋白表達(dá)分析

低溫條件下提取右肺組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，具體方法詳見(jiàn)我們前期的研究結(jié)果[5]。相關(guān)蛋白一抗?jié)舛确謩e為α-SMA(1∶1 000)、Vimentin(1∶ 1 000)、ZO-1(1∶500)、E-cadherin(1∶1 000)、collagen I(1∶500)、TRPV1(1∶500)、eIF3a(1∶ 1 000)及GAPDH(1∶2 000)，相應(yīng)二抗?jié)舛?1∶ 2 000～1∶5 000)。用Image J 1.43軟件進(jìn)行灰度值測(cè)量并分析蛋白表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小劑量Cap對(duì)纖維化小鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)CON組肺泡結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥反應(yīng)，而B(niǎo)LM組肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔狹窄、萎縮，肺泡血管壁增厚，大量成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集。而經(jīng)小劑量Cap干預(yù)21 d后，上述病理變化明顯減輕。但當(dāng)使用辣椒素受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，小劑量Cap的作用被明顯抑制(圖1)。

Fig. 1 Effects of capsaicin on lung histopathological changes in lung tissues(HE staining ×200)

2.2 小劑量Cap對(duì)纖維化小鼠肺組織膠原變化的影響

改良的Masson染色結(jié)果顯示CON組藍(lán)染的膠原纖維較少，而B(niǎo)LM組藍(lán)染的膠原纖維明顯增多。經(jīng)小劑量Cap干預(yù)21 d后，藍(lán)染的膠原纖維明顯減少。但當(dāng)使用辣椒素受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，藍(lán)染的膠原纖維又明顯增多(圖2)。同時(shí)，經(jīng)qPCR、Western blot和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BLM組collagen I 和collagen III的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而經(jīng)小劑量Cap干預(yù)21 d后collagen I 和collagen III的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。但當(dāng)使用辣椒素受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，小劑量Cap的這些作用被明顯取消。表明小劑量Cap能夠改善肺纖維化肺組織的膠原沉積(表2，圖3，圖4)。

Fig. 2 Effects of capsaicin on collagen levels in lung tissues(Masson’s staining ×200)

Tab. 2 Effects of Cap on collagen I and collagen III expressions in lung tissues n=9)

Fig. 3 Effects of capsaicin on collagen I in lung tissues by Western blot

Fig. 4 Effects of capsaicin on collagen III in lung tissues by immunohistochemical staining (×200)

2.3 小劑量Cap對(duì)纖維化小鼠肺泡上皮細(xì)胞EMT的影響

與CON組相比，BLM組肺泡上皮細(xì)胞標(biāo)志物ZO-1 和E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與BLM組相比，Cap不同劑量組ZO-1 和E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)不同程度升高而α-SMA和Vimentin mRNA及蛋白表達(dá)不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。但當(dāng)使用辣椒素受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，小劑量Cap對(duì)肺泡上皮細(xì)胞EMT的影響明顯降低(表3，表4，圖5)。

Tab. 3 Effect of Cap on ZO-1,E-cadherin, Vimentin and α-SMA mRNA expressions in lung tissues n=9)

Tab. 4 Effect of Cap on ZO-1,E-cadherin, Vimentin andα-SMA protein expressions in lung tissues n=9)

Fig. 5 Effects of Cap on ZO-1,E-cadherin, Vimentin and α-SMA in lung tissues by Western blot

2.4 小劑量Cap對(duì)纖維化小鼠肺組織TRPV1受體及CGRP表達(dá)的影響

與CON組相比，BLM組TRPV1表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)肺組織CGRP mRNA表達(dá)水平及血漿CGRP的濃度明顯降低(P<0.01)。與BLM組相比，而經(jīng)小劑量Cap干預(yù)21 d后，TRPV1表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)肺組織CGRP mRNA表達(dá)水平及血漿CGRP的濃度明顯升高(P<0.05或P<0.01)。但當(dāng)使用辣椒素受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，肺組織CGRP mRNA表達(dá)水平及血漿CGRP的濃度又明顯降低(P<0.01)。表明小劑量Cap可能通過(guò)激動(dòng)TRPV1受體而促進(jìn)CGRP的釋放而產(chǎn)生抗纖維化作用(圖6，表5)。

Fig. 6 Effects of Cap on TRPV1 in lung tissues by Western blot

Tab. 5 Effect of Cap on TRPV1 and CGRP expressions n=9)

2.5 小劑量Cap對(duì)纖維化小鼠肺組織ERK1/2/eIF3a信號(hào)通路的影響

與CON組相比，BLM組肺組織ERK1/2磷酸化水平及eIF3a蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。與BLM組相比，Cap不同劑量組ERK1/2磷酸化水平及eIF3a蛋白表達(dá)水平不同程度降低(P<0.05或P<0.01)。但當(dāng)使用辣椒素受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，ERK1/2磷酸化水平及eIF3a蛋白表達(dá)水平又明顯升高(表6，圖7)。

Tab. 6 Effects of Cap on Phospho-p44/42 and eIF3a expressions in lung tissues n=9)

Fig. 7 Effects of Cap on Phospho-p44/42 and eIF3a in lung tissues by Western blot

3 討論

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)是上皮細(xì)胞逐漸向間充質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，喪失上皮細(xì)胞功能特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞(如MFb)特性的過(guò)程，在PF的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]。在此過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去了一些細(xì)胞標(biāo)志物，如ZO-1 和E-cadherin，獲得了間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如α-SMA和Vimentin，最終異常的上皮細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞或MFb，并且產(chǎn)生過(guò)多的ECM并破壞肺組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生[3]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，抑制肺泡上皮細(xì)胞EMT，在一定程度上能夠緩解肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展[12]。Cap是一種脂溶性的生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用[7]。Bitencourt[13]等人研究發(fā)現(xiàn)，Cap能夠明顯緩解膽汁淤積導(dǎo)致的肝纖維化。Xu[8]等人研究發(fā)現(xiàn)Cap能夠抑制人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的的粘附、遷移和侵襲。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)劑量Cap連續(xù)給藥21 d后，肺泡上皮細(xì)胞EMT明顯減輕(肺組織ZO-1 和E-cadherin的表達(dá)明顯升高而α-SMA和Vimentin的表達(dá)明顯降低)，肺組織膠原沉積明顯減輕(肺組織藍(lán)染的膠原纖維明顯減少，collagen I 和collagen III的表達(dá)明顯降低)，肺纖維化程度明顯緩解，且Cap (2 mg/kg)劑量組的緩解作用明顯高于Cap (0.5 mg/kg)劑量組和(1 mg/kg)劑量組。表明小劑量Cap能夠緩解博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。

目前已知Cap的鎮(zhèn)痛、抗癌、抗纖維化等作用與其激動(dòng)體內(nèi)受體TRPV1有關(guān)。TRPV1受體是一種非選擇性的陽(yáng)離子通道，廣泛分布于感覺(jué)神經(jīng)纖維和非神經(jīng)細(xì)胞上(如內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等)[14]。Qu等人研究發(fā)現(xiàn)Cap通過(guò)激動(dòng)TRPV1受體，釋放擴(kuò)血管物質(zhì)P物質(zhì)而緩解野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓[15]。Zhong等人研究發(fā)現(xiàn)N-油酰多巴胺通過(guò)激動(dòng)TRPV1受體，促進(jìn)內(nèi)源性P物質(zhì)和CGRP的釋放而對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用[16]。Li等人研究發(fā)現(xiàn)Cap是通過(guò)激活TRPV1 而產(chǎn)生NO、CGRP 而產(chǎn)生心血管保護(hù)作用[11,12]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)激動(dòng)TRPV1受體介導(dǎo)的CGRP釋放也參與BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[17]。而大劑量Cap(50 mg/kg)連續(xù)給藥3 d耗竭體內(nèi)P物質(zhì)和CGRP后，能夠明顯加重BLM誘導(dǎo)的肺纖維化[5]。以上結(jié)果提示CGPR參與肺纖維化的疾病過(guò)程，促進(jìn)內(nèi)源性CGRP的緩慢釋放有望緩解肺纖維化。而研究發(fā)現(xiàn)，而經(jīng)3個(gè)劑量Cap干預(yù)21 d后，TRPV1表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)肺組織及血漿CGRP的水平明顯升高，且Cap (2 mg/kg)劑量組的上調(diào)作用明顯高于Cap (0.5 mg/kg)劑量組和(1 mg/kg)劑量組；但當(dāng)使用TRPV1受體阻斷劑SB-452533阻斷辣椒素受體后，CGRP的水平又明顯降低，Cap抗肺纖維化作用明顯減弱。表明小劑量Cap可能通過(guò)激動(dòng)TRPV1受體而促進(jìn)CGRP的釋放而產(chǎn)生抗肺纖維化作用。

目前大量的研究表明TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT在肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[18]。Wang等人發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路等介導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞EMT，但其具體的下游靶點(diǎn)不是很清楚[19]。我們的研究結(jié)果也顯示，在博萊霉素誘導(dǎo)發(fā)肺纖維化肺組織中ERK1/2的磷酸化水平和eIF3a的表達(dá)明顯升高，而抑制eIF3a的表達(dá)后，肺纖維化程度明顯減輕[5,20]。在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，ERK1/2/eIF3a信號(hào)通路介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT，而外源性CGRP能夠明顯抑制ERK1/2的磷酸化，降低eIF3a的表達(dá)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞EMT[6]。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)劑量Cap能夠分別明顯降低肺組織ERK1/2的磷酸化水平、抑制eIF3a的表達(dá)，且Cap (2 mg/kg)劑量組的抑制作用明顯高于Cap (0.5 mg/kg)劑量組和(1 mg/kg)劑量組；而Cap的這一作用能夠被TRPV1受體阻斷劑SB-452533所取消。表明小劑量Cap可能通過(guò)激動(dòng)TRPV1，促進(jìn)內(nèi)源性CGRP的釋放，抑制肺組織ERK1/2的過(guò)度磷酸化及eIF3a的表達(dá)而產(chǎn)生抗肺纖維化作用。

綜述所述，小劑量Cap能夠逆轉(zhuǎn)肺泡上皮細(xì)胞EMT、緩解肺纖維化。其機(jī)制可能與其激動(dòng)TRPV1、促進(jìn)CGRP釋放，進(jìn)而抑制ERK磷酸化和下調(diào)eIF3a的表達(dá)有關(guān)。