陳宇峰，董凡赫，樓云瑋，壽今豪，張慧婷，周一超，嚴(yán) 明，毛紅嬌，張 云△

(1. 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000； 2. 杭州電子科技大學(xué)自動化學(xué)院，浙江 杭州 310018)

人工關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后經(jīng)過長期磨損、碰撞會產(chǎn)生大量的聚乙烯類、金屬類和陶瓷類等磨損顆粒，這些微米粒徑的細(xì)小顆粒可抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能[1-3]。同時，磨損顆粒還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的凋亡，釋放IL-6、PGE2和IL-18等炎癥因子[4, 5]，這些因子可促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化和骨吸收，造成假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)無菌性松動。有研究表明，肌醇依賴酶1α(inositol dependent enzyme 1 alpha，IRE1α))是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種跨膜信號蛋白之一，被激活后可剪切XBP1，并激活其下游細(xì)胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶 1(apoptosis signal regulating kinase1，ASK1)及 C-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2014年Liu等[6]報道納米合金顆粒在誘導(dǎo)假體周圍成骨細(xì)胞凋亡過程中伴隨著葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)和IRE1α表達(dá)的上調(diào)，而腹腔注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑4-苯基丁酸可顯著抑制上述反應(yīng)，這說明IRE1α介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路可能在磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍成骨細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮重要作用，可作為治療假體周圍成骨細(xì)胞凋亡及損傷的治療靶點。

補(bǔ)骨脂素(psoralen)是從豆科植物補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥果實中提取的有效活性成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗表明補(bǔ)骨脂素具有抗腫瘤、抗氧化和抗炎作用[7, 8]。有研究顯示補(bǔ)骨脂素具有雌激素樣作用，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[9]。最近，Chen等[10]報道，補(bǔ)骨脂素能顯著抑制絕經(jīng)后患有骨質(zhì)疏松癥婦女髖關(guān)節(jié)中的成骨細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化。但是，補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過TCP磨損顆粒與成骨細(xì)胞共孵育構(gòu)建成骨細(xì)胞損傷的體外實驗?zāi)Ｐ?，研究補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的影響，并闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及IRE1α-XBP1s-JNK信號通路在其中所發(fā)揮的作用，以期為補(bǔ)骨脂素治療假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

SPF級1日齡SD大鼠，購于浙江省軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心(實驗動物許可證號：SCXK(浙)2014-0001，合格證號1712060013)。

TCP磨損顆粒由浙江大學(xué)化學(xué)系饋贈；補(bǔ)骨脂素(HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；WST-1試劑盒、BCA試劑盒、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所；茜素紅S染液購自Solarbio Life Sciences公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和小鼠抗β-actin抗體購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；兔抗GRP78/94抗體、兔抗IRE1α抗體、兔抗XBP1s抗體、兔抗JNK抗體、兔抗p-JNK(p-JNK)和小鼠抗β-actin抗體等購于美國Cell Signaling公司；PVDF膜購于美國Millipore公司。

1.2 成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[11]

取1日齡SD大鼠斷頭處死經(jīng)75%乙醇消毒5 mim后，剝離顱蓋骨置于PBS液中，去除骨膜和軟組織，用PBS沖洗2次，剪成1 mm3碎塊；然后用 0.25%胰蛋白酶消化15 min，再用Ⅱ型膠原酶(1 mg/ml)37℃消化90 min，收集細(xì)胞懸液，加入等體積含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。通過2～3次差速貼壁法去除成骨細(xì)胞中混雜的成纖維細(xì)胞，從而獲得高純度的成骨細(xì)胞。分離得到的成骨細(xì)胞分別應(yīng)用0.4%臺盼藍(lán)染色和ALP染色進(jìn)行活性檢測和鑒定。

純化后的成骨細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)24 h后換液，待瓶內(nèi)細(xì)胞的80%鋪滿瓶底時，加入0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，后續(xù)實驗用3～5代成骨細(xì)胞，接種密度為1×104cells/well。

1.3 模型的構(gòu)建與實驗分組

成骨細(xì)胞與TCP磨損顆粒(0.1 mg/ml)共孵育48 h構(gòu)建成骨細(xì)胞損傷的體外實驗?zāi)Ｐ汀嶒炿S機(jī)分組為5組：(1)正常對照組(Contro1)：細(xì)胞正常培養(yǎng)，不做任何處理；(2)模型(TCP，0.1 mg/ml)組：按照上述損傷模型方法培養(yǎng)48 h；(3)補(bǔ)骨脂素干預(yù)組：補(bǔ)骨脂素(10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L)預(yù)處理4 h后，加入TCP(0.1 mg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組設(shè)4～6個復(fù)孔，并設(shè)置 3～4次獨立重復(fù)實驗。

1.4 WST-1法檢測成骨細(xì)胞活性

成骨細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，分別按照分組進(jìn)行處理。然后加入WST-1(每孔20 μl)溫室避光孵育1 h，置于酶標(biāo)儀下測定OD450nm，并計算成骨細(xì)胞活性的變化，確定補(bǔ)骨脂素的最佳干預(yù)劑量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測成骨細(xì)胞凋亡

成骨細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，分別按照分組進(jìn)行處理。通過消化獲取成骨細(xì)胞，經(jīng) 1 000 r/min離心10 min后去除培養(yǎng)基，PBS清洗2次。 然后加入5 μl Annexin V-FITC/10 μl碘化丙啶(PI)，避光室溫37℃溫育15 min。最后加入200 μl PBS并混勻后上流式細(xì)胞儀檢測各組成骨細(xì)胞凋亡情況。FITC的激發(fā)波長為488 nm，檢測發(fā)射波長575 nm。

1.6 化學(xué)比色法檢測成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性

ALP為成骨細(xì)胞分化時所分泌，ALP活性與成骨細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)[12]。成骨細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，分別按照分組進(jìn)行處理。棄去上清，PBS清洗2次，0.1%TritonX-100作用30 min后收集裂解液，應(yīng)用ALP試劑盒測定成骨細(xì)胞ALP活性。

1.7 礦化結(jié)節(jié)形成觀察

成骨細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，采用補(bǔ)骨脂素(10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)預(yù)孵育4 h后，分別加入TCP磨損顆粒(0.1 mg/ml)分別繼續(xù)孵育14 d，隔日換藥1次。14 d后，當(dāng)見到較多不透明的礦化結(jié)節(jié)時取出培養(yǎng)板，PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定10 min。棄固定液，PBS清洗3次后與0.1%茜素紅染液孵育30 min，PBS清洗后置于顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。對橘紅染色且邊界較清晰，短徑大于100 μm的結(jié)節(jié)進(jìn)行計數(shù)，并比較各組礦化結(jié)節(jié)形成情況。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)[13]

成骨細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，分別按照分組進(jìn)行處理。去除上清液后每孔加入RIPA裂解液(80 μl)冰上裂解30 min。經(jīng)13 000 r/min離心15 min上清液，利用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度。各組蛋白經(jīng)煮沸10 min，冷卻后每孔上樣30 μg蛋白，行15%SDS-PAGE分離蛋白，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)10%脫脂牛奶常溫封閉2 h后，分別加入兔抗GRP78/94抗體(1∶ 1 000稀釋)、兔抗IRE1α抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗XBP1s抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗JNK抗體(1∶ 1 000稀釋)和兔抗phospho-JNK(p-JNK)抗體(1∶ 1 000稀釋)和小鼠抗β-actin抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的二抗(TBST配制)室溫孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL顯色液，通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白表達(dá)的變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定

分離得到的細(xì)胞具有典型成骨細(xì)胞的形態(tài)特征，呈梭形或多邊形，時有突起(圖1A)。ALP染色后胞質(zhì)中含有灰黑色顆粒狀或塊狀沉淀，即ALP染色呈陽性(圖1B)，表明從1日齡SD乳鼠顱骨中分離得到細(xì)胞為高純度的成骨細(xì)胞。另外，臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示活細(xì)胞數(shù)為96.7%，可滿足后續(xù)的實驗研究。

Fig. 1 Representative photograps of calvarial osteoblasts(×200)

2.2 補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞增殖的影響

與Control組比較，補(bǔ)骨脂素濃度在10-8mol/L-10-4mol/L時細(xì)胞活性明顯增加，表明補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，且能促進(jìn)細(xì)胞增殖。其中10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L促增殖作用最為顯著(圖2，P<0.05)。因此，本研究選取10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L為干預(yù)劑量，研究補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷的影響。

Fig. 2 Effect of psoralen on cell viability of calvarial osteoblasts ( n=4)

2.3 補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖、ALP活性及礦化結(jié)節(jié)的影響

與Control組比較，TCP組成骨細(xì)胞活性、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量明顯減少(表1，P< 0.05)；與TCP組比較，補(bǔ)骨脂素各組成骨細(xì)胞活性、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)目顯著增加，其中補(bǔ)骨脂素(10-6mol/L)組抑制TCP磨損顆粒所致成骨細(xì)胞損傷的作用最強(qiáng)，而其余兩組的抑制作用稍弱(表1，P<0.05)。

Tab. 1 Effect of psoralen on the decrease of cell viability, ALP activity and in the number of mineralized nodules caused by TCP particles in calvarial osteoblasts n=4)

2.4 補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)定量分析顯示：與Control組比較，TCP組成骨細(xì)胞凋亡顯著增加，凋亡率增加為Control組的7.19倍(圖3，表2，P<0.05)；與TCP組比較，補(bǔ)骨脂素組成骨細(xì)胞凋亡明顯降低，其凋亡率分別減少為TCP組的73.72%(10-7mol/L)、39.61%(10-6mol/L)和58.93%(10-5mol/L)，以補(bǔ)骨脂素(10-6mol/L)組抑制成骨細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)(圖3，表2，P<0.05)。

Fig. 3 Apoptosis analyzed by the flow cytometry

Tab. 2 Effect of psoralen on apoptosis of calvarial osteoblasts caused by TCP wear particles (%， n=4)

2.5 補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞IRE1α通路活化的影響

與Control組比較，TCP組成骨細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并激活I(lǐng)RE1α-XBP1s-JNK信號通路，表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78/94及IRE1α通路蛋白質(zhì)IRE1α、XBP1s和p-JNK等表達(dá)均明顯上調(diào)(圖4，表3，P<0.05)；與TCP組比較，補(bǔ)骨脂素(10-6mol/L 、10-5mol/L)組成骨細(xì)胞中GRP78/94、IRE1α、XBP1s和p-JNK等蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)，其中補(bǔ)骨脂素(10-6mol/L)組對上述蛋白質(zhì)表達(dá)的影響最為顯著，而補(bǔ)骨脂素(10-5mol/L)組的作用稍弱于補(bǔ)骨脂素(10-6mol/L)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4，表3，P<0.05)。

Fig. 4 Protein expressions of IRE1α signaling pathway examined by Western blot

GRP78/94: Glucose regulated protein 78/94; IRE1α: Inositol-requiring enzyme 1α; XBP1s: X-box binding protein1 spliced; p-JNK: phosphorylated c-Jun N-terminal kinase; TCP: tricalcium phosphate

Tab. 3 Effect of psoralen on activation of IRE1α-XBP1s-JNK signaling pathway caused by TCP wear particles in calvarial osteoblasts n=4)

3 討論

磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解是導(dǎo)致假體晚期松動及關(guān)節(jié)置換失敗的主要原因之一[14, 15]。有研究表明，PE、TCP和Ti等磨損顆?？烧T導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷及凋亡[1-4]，與翻修術(shù)假體周圍成骨細(xì)胞損傷情況基本一致[16]。本研究結(jié)果也顯示：TCP磨損顆粒與成骨細(xì)胞孵育48 h可明顯抑制成骨細(xì)胞活性、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)的生成，并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，釋放PGE2、IL-6和IL-18等因子[1, 5]，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞活化與骨溶解。提示：成骨細(xì)胞在磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解中發(fā)揮重要的作用，是防治假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動的另一種靶細(xì)胞。

補(bǔ)骨脂素是從豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL的成熟果實中分離出的一種香豆素類化合物，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，抑制破骨細(xì)胞性骨吸收并增加骨密度的雌激素樣作用。有報道指出補(bǔ)骨脂素可刺激成骨細(xì)胞分泌Collagen I、OCN、OPN 和 ALP，劑量依賴性地上調(diào)BMP-2和BMP-4等基因的表達(dá)，并增加磷酸化Smad1、Smad5、Smad8和Osterix等蛋白水平，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化[9]。此外，補(bǔ)骨脂素還能抑制雌激素缺乏所致的成骨細(xì)胞凋亡[10]，阻止破骨細(xì)胞生成及骨溶解。本文研究補(bǔ)骨脂素對TCP磨損顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡的影響，結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素可顯著抑制TCP磨損顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活性的降低、功能的損傷，減少成骨細(xì)胞凋亡，但是其調(diào)控機(jī)制目前還不清楚。

有研究證實內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控成骨細(xì)胞凋亡[16-19]，可能在假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動中發(fā)揮重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、修飾和折疊的場所。缺氧、葡萄糖缺乏、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常及Ca2+耗竭等病理刺激均可誘導(dǎo)未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量堆積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。IRE1α又稱核酸內(nèi)切酶，是ER膜上的I型跨膜蛋白，在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，IRE1α與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/94結(jié)合在一起，處于無活性狀態(tài)。而當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時，IRE1α與GRP78/94解離后，剪切細(xì)胞質(zhì)中XBP1形成剪切型 XBP1( XBP1s)，后者進(jìn)入細(xì)胞核與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件結(jié)合，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78/94蛋白的表達(dá)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[20]。但是，發(fā)生嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，活化后IRE1α還募集腫瘤壞死因子受體(TNF-receptor associated factor 2，TNFR2)，并與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(ASK1)形成TRAF2-ASK1-JNK復(fù)合體，激活其下游JNK通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21, 22]。本研究結(jié)果顯示：TCP組成骨細(xì)胞中GRP78/94、IRE1α、XBP1s和p-JNK等蛋白質(zhì)表達(dá)明顯上調(diào)，這說明在TCP磨損顆粒誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程中IRE1α-XBP1-JNK通路被激活。補(bǔ)骨脂素干預(yù)后成骨細(xì)胞中GRP78/94、IRE1α、XBP1s和p-JNK等蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示補(bǔ)骨脂素可顯著減弱TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及IRE1α-XBP1通路的活化，抑制其下游JNK的磷酸化，從而阻止成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡，其趨勢與補(bǔ)骨脂素對成骨細(xì)胞的活性、ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成等指標(biāo)的影響一致。

綜上，補(bǔ)骨脂素可通過減弱IRE1α-XBP1s-JNK信號通路的活化而干預(yù)TCP磨損顆粒誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷，從而減輕假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)晚期松動。本研究旨在為治療假體周圍骨溶解和關(guān)節(jié)松動提供新思路、新方法和新的治療靶標(biāo)。