宋海巖，張毅敏，連 輝，周 立

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

在實體腫瘤，缺氧是一種常見的特性,并成為促進腫瘤進展的強大驅(qū)動力和治療失敗的主要原因[1, 2]。缺氧可誘導(dǎo)腫瘤細胞的生物學(xué)特性改變及腫瘤細胞微環(huán)境的變化，從而進一步導(dǎo)致腫瘤細胞生長更快、腫瘤細胞的侵襲力增強。乳腺癌是影響女性健康的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位于惡性腫瘤之首[3]。

研究顯示吉西他濱(gemcitabine，GEM)是對乳腺癌有明顯的治療效果[4,5]，但由于其有較強的毒副作用及腫瘤細胞耐藥的發(fā)生，不僅影響治療效果，也影響患者的生存質(zhì)量。通過臨床前試驗，奧巴克拉(obatoclax，OBX)可作為抑制劑抑制腫瘤細胞與移植瘤的生長[6]。本研究以乳腺癌MCF-3與BT-20為研究對象，研究在低氧條件OBX聯(lián)合GEM對腫瘤細胞活性、凋亡、遷移、侵襲能力的影響，為臨床乳腺癌的治療提供更多的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞系MCF-7與BT-20購自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，培養(yǎng)液為DMEM(含10% FBS, 100 U/L青霉素及100 μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d傳代1次，對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

1.2 主要試劑

DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)培養(yǎng)液 購自于Hyclone，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自于Gibco，gemcitabine、obatoclax 購自于Sigma公司，青鏈霉素溶液，CCK-8試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)研究所，HIF-1α 抗體購自于BD Biosciences公司，GAPDH抗體購自于Sigma公司 ，vimentin抗體(sc-6260)，E-Cadherin抗體(sc-71009),p53抗體(sc-126)購自于SANTA CRUZ公司。

1.3 細胞分組

正常培養(yǎng)組；低氧組(低氧誘導(dǎo)條件為37℃，1%O2，5% CO2,94% N2)；

吉西他濱(GEM)(10 μmol/L)組；OBX(50 nmol/L)+吉西他濱(GEM)(10 μmol/L)組。正常培養(yǎng)組：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h與48 h；低氧組：37℃，1%O2，5% CO2,94% N2條件下培養(yǎng)24 h與48 h；吉西他濱(GEM)組：37℃，1%O2，5% CO2,94% N2，加入終濃度為10 μmol/L的吉西他濱培養(yǎng)24 h與48 h；OBX+吉西他濱(GEM)組：37℃，1%O2，5% CO2,94% N2，加入終濃度為10 μmol/L的吉西他濱與終濃度為50 nmol/L的OBX培養(yǎng)24 h和48 h。

1.4 WB檢測低氧組與正常組HIF-1α的表達

接種MCF-3與BT-20細胞，37℃培養(yǎng)12 h后，低氧組細胞在低氧條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入500 μl RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。SDS-PAGE電泳80V 30 min、120 V 1 h，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，HIF-1α 抗體(1∶500)及GAPDH抗體(1∶10 000)4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1.5 h后，Odyssey掃膜。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.5 CCK-8檢測細胞的活性

MCF-3與BT-20細胞接種于96孔中培養(yǎng)12 h，GEM組加入終濃度為10 μmol/L的GEM；OBX+GEM組加入終濃度為50 nmol/L的OBX和終濃度為10 μmol/L的GEM，低氧組、GEM組與OBX+GEM組于低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入100 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)2 h后，酶標儀450 nm處測OD值。每組設(shè)置15個復(fù)孔。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

參考文獻[7]中報道，將細胞接種于6孔板中培養(yǎng)12 h后細胞鋪滿培養(yǎng)板底部，用1 ml的無菌藍色吸頭在孔的中間劃痕，盡量保證每一個孔中劃痕的寬度一致。棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 ml無血清培養(yǎng)液以洗去懸浮的細胞，加入正常培養(yǎng)液，拍照并且記錄位置, 此處為0 h的劃痕，各組細胞處理方法如細胞分組中所述，各組均培養(yǎng)48 h，每組設(shè)置6個復(fù)孔，顯微鏡下觀察細胞的遷移情況并拍照，利用Image J軟件計算細胞愈合率。

1.7 WB檢測各組vimentin，E-Cadherin, p53的表達

培養(yǎng)24 h的各組細胞，棄去培養(yǎng)液，每皿加入500 μl RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，vimentin 抗體(1∶500)、E-Cadherin抗體(1∶500)、p53抗體(1∶500)及GAPDH抗體(1∶10 000)4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1.5 h后，Odyssey曝光，Image J軟件分析灰度值。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧條件下HIF-1α的表達情況

Western blot結(jié)果顯示：正常氧條件下，MCF-7與BT-20細胞中并不表達HIF-1α(0.000±0.00)；而在低氧條件下，MCF-7與BT-20細胞中HIF-1α的表達顯著(0.457±0.019, 0.443±0.011)，二者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

Fig. 1 The expression of HIF-1α in MCF-7 and BT-20 cells under normal oxygen and hypoxia condition

2.2 低氧條件下GEM與OBX+GEM對細胞活性的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示：與正常氧組相比，低氧組MCF-7與BT-20細胞活性明顯升高(P<0.05)；與低氧組相比較，GEM組與OBX+GEM組細胞活性均有下降(P<0.05)，OBX+GEM組細胞與GEM組細胞相比較，細胞活性進一步降低(P<0.01)，這就提示，OBX聯(lián)合GEM可顯著降低低氧條件下MCF-7與BT-20細胞的活性(表1)。

Tab. 1 Cell activity of MCF-7 and BT-20 cells detected by CCK-8 n=15)

2.3 低氧條件下GEM與OBX+GEM對細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示：與正常氧組比較，低氧組 MCF-7與BT-20細胞的愈合面積明顯大于正常氧對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與低氧組相比較，GEM與OBX+GEM組細胞的愈合面積顯著降低(P<0.01)，并且OBX+GEM組細胞的愈合面積下降的更為顯著，這表明OBX聯(lián)合GEM可顯著降低低氧條件下MCF-7與BT-20細胞的遷移能力(圖2，表2)。

Fig. 2 Migration ability of MCF-7 and BT-20 cells detected by scratch experiment

Tab. 2 Migration ability of MCF-7 and BT-20 cells detected by scratch experiment(% wound closure) n=6)

2.4 低氧條件下GEM與OBX+GEM對相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果如圖3，表3所示：與正常氧組比較，低氧組MCF-7細胞中vimentin的表達顯著升高(P<0.01)，而E-Cadherin的表達顯著降低(P< 0.01), p53蛋白的表達無明顯改變；與低氧組相比較，GEM組與OBX+GEM組，vimentin的表達降低(P<0.01)，E-Cadherin的表達顯著升高(P<0.01)，p53蛋白的表達也顯著升高(P<0.01)，并且OBX+GEM組的作用更顯著，這表明OBX聯(lián)合GEM作用于低氧條件下的MCF-7細胞，細胞特性發(fā)生改變，從間質(zhì)樣特征恢復(fù)上皮樣特征，同時細胞凋亡相關(guān)p53的表達顯著升高，OBX聯(lián)合GEM可促進低氧條件下的細胞凋亡。

Fig. 3 The expressions of vimentin, E-cadherin and p53 protein in each group of MCF-7 cells detected by Western blot

Tab. 3 The expressions of vimentin, E-cadherin and p53 protein in each group of MCF-7 cells detected by Western blot (Relative gray density) n=5)

3 討論

乳腺癌是影響全世界女性健康最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)最新統(tǒng)計,其發(fā)病率在全世界女性腫瘤疾病中列第一位,引起女性死亡相關(guān)癌癥的第一大因素[3]。盡管，目前隨著化療藥物的迅猛發(fā)展，乳腺癌患者的生存期有較大程度的延長，但是對耐藥患者的治療效果還不容樂觀。

惡性腫瘤在發(fā)展的過程中，由于生長過快腫瘤細胞常常處于氧氣與營養(yǎng)不足的狀態(tài)，在實體腫瘤，缺氧是一種常見的特性,并成為促進腫瘤進展的強大驅(qū)動力和治療失敗的主要原因[1, 2]。低氧可誘導(dǎo)腫瘤細胞的生物學(xué)特性改變，腫瘤細胞微環(huán)境的變化，藥物的輸送障礙及腫瘤細胞對藥物耐藥的發(fā)生，從而進一步導(dǎo)致腫瘤細胞生長更快，細胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition ，EMT)，腫瘤細胞的侵襲力增強[8-10]。在EMT過程中，E-Cadherin的表達下調(diào)，預(yù)示著腫瘤細胞失去其上皮樣特征，同時間質(zhì)標記物vimentin的表達上調(diào)，這種轉(zhuǎn)換會導(dǎo)致腫瘤細胞遷移侵襲的能力增強，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[11, 12]。因此，針對低氧條件下細胞特征而采用的治療策略可能取得較好的治療效果。

吉西他濱為脫氧胞嘧啶核苷的類似物, 是核苷酸還原酶抑制劑, 在細胞內(nèi)通過脫氧胞嘧啶核苷激酶磷酸化, 轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸及三磷酸核苷, 從而發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。研究顯示吉西他濱對乳腺癌有明顯的療效，但由于其有較強的毒副作用及腫瘤細胞耐藥的發(fā)生，不僅影響治療效果，也影響患者的生存質(zhì)量。通過臨床前試驗，奧巴克拉(obatoclax，OBX)是一種BH3類似物，可作為抑制劑抑制腫瘤細胞與移植瘤的生長[6]。與正常氧條件相比較，在低氧條件下，BH3類似物ABT-737更能發(fā)揮其對腫瘤細胞的作用效率[13, 14]。研究顯示，奧巴克拉可降低低氧條件HIF-1α的表達水平，從而提高結(jié)腸癌細胞對5-fluorouracil的敏感性[15]。但是奧巴克拉聯(lián)合吉西他濱是否能改變低氧條件下乳腺癌細胞的侵襲性表型，提高吉西他濱的作用效率，還未見報道。

本研究中結(jié)果顯示，在低氧條件下，乳腺癌細胞MCF-7與BT-20的遷移能力增強，細胞活性增強，奧巴克拉聯(lián)合小劑量的吉西他濱可顯著降低二者的愈合面積，降低它們的遷移能力與活性；奧巴克拉聯(lián)合小劑量的吉西他濱，可改變?nèi)橄侔┘毎鸐CF-7細胞的惡性表型，促進上皮標記物E-Cadherin的表達，降低間充質(zhì)標記物Vimentin的表達，使腫瘤細胞恢復(fù)上皮樣細胞的特征，降低腫瘤細胞遷移侵襲的能力，促進p53的表達，促進腫瘤細胞的凋亡，從而提高腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性。本研究針對低氧條件下細胞特征，將奧巴克拉與吉西他濱聯(lián)合使用，通過減少吉西他濱的用量，減少其毒副作用，提高吉西他濱的作用效率，也減輕病人的痛苦。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明在低氧條件下，OBX聯(lián)合小劑量吉西他濱可顯著抑制乳腺癌細胞的生長，遷移，侵襲，增強吉西他濱對乳腺癌細胞的促凋亡作用，將為臨床乳腺癌的治療提供更多的實驗依據(jù)，但具體機制尚需要進一步研究。