扈 敬，李法東，邵小婷，李思葳，張欣穎，趙冰冰，徐長慶，魏 璨

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150086)

糖尿病是全球常見的以代謝紊亂為特征的疾病[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病的重要并發(fā)癥，作為獨(dú)立于高血壓、冠心病等特異性心肌病，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，可能涉及代謝紊亂、心肌纖維化、氧化應(yīng)激、心肌細(xì)胞凋亡等[2]。心肌纖維化是糖尿病心肌病心肌重構(gòu)的重要標(biāo)志,也是導(dǎo)致心臟功能和結(jié)構(gòu)改變的重要原因[3]。然而，糖尿病心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，迄今尚不清楚。

心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts, CFs)在心肌間質(zhì)含量豐富，約占總量90%，在心臟發(fā)育和重塑中發(fā)揮著重要作用[4]。正常情況下，心肌成纖維細(xì)胞少量分泌膠原蛋白，可維持心臟的結(jié)構(gòu)、功能、生化、電傳導(dǎo)等。糖尿病心肌病時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞的過度增殖和基質(zhì)膠原蛋白的過多分泌，可促進(jìn)心臟纖維化，影響心肌的收縮和舒張功能[5]。因此進(jìn)一步揭示心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白沉積的機(jī)制，成為諸多研究者的關(guān)注熱點(diǎn)。

哺乳動(dòng)物中普遍存在的多胺(腐胺、亞精胺和精胺)，來源于氨基酸的低分子量有機(jī)陽離子化合物，參與調(diào)控基因表達(dá)、翻譯、細(xì)胞增殖等過程，具有抗炎、抗氧化等作用，還可以調(diào)節(jié)某些離子通道的活性和細(xì)胞凋亡[6, 7]。其中精胺(spermine，Sp)具有四個(gè)正電荷，生物學(xué)效應(yīng)最顯著。本課題組前期研究證實(shí)，糖尿病心肌病大鼠多胺代謝紊亂，內(nèi)源性精胺減少，進(jìn)一步觸發(fā)鈣穩(wěn)態(tài)失衡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激，引起心肌損傷；給予外源性精胺有明顯心肌保護(hù)作用[8, 9]。但是，多胺(精胺)在糖尿病心肌纖維化中的作用尚未完全闡明。本文在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探討外源性精胺能否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期對(duì)糖尿病心肌纖維化發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理

選取 24 只體重220～250 g 雄性Wistar大鼠(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，隨機(jī)分成 3 組(n=8)：正常對(duì)照組(Control)、糖尿病模型組(T1D)和精胺組(T1D+Sp)。適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，禁食12 h，采用 STZ(60 mg/kg，溶于0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)一次性腹腔注射，制備 T1D 大鼠模型；Control 組注射相同體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；T1D+Sp 組 STZ 注射前連續(xù)兩周每天腹腔注射精胺(5 mg/(kg·d))，隨后隔天注射精胺至 12 周。注射 STZ 3 d 后，大鼠尾靜脈采血測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose concentration，F(xiàn)BG)，以 FBG ≥ 16.7 mmol/L認(rèn)為是大鼠糖尿病模型復(fù)制成功[10]。其間，每周測(cè)量大鼠血糖與體重的變化。12周后，禁食12 h，處死各組大鼠，取血液樣本及心臟組織。

1.2 超聲檢測(cè)大鼠心臟功能

注射 STZ 前和注射 12 周后分別進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。各組大鼠麻醉后將胸毛剪掉，應(yīng)用 GE-VIVID7-10S 探頭，在 10 Hz 頻率下分別檢測(cè)大鼠的射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)。

1.3 心臟組織 Masson 染色和 Sirius red 染色

將心臟組織以 10% 甲醛在 4℃ 下固定 12 h，制備成 5 μm 厚度的石蠟切片，逐級(jí)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。Masson 染色：用 Weigert 蘇木精染核 5～10 min，充分水洗，Masson 麗春紅酸性復(fù)紅染 5～10 min，用 2% 冰醋酸浸洗片刻，1% 磷鉬酸分化 3～5 min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍(lán)染 5 min，用 0.2% 冰醋酸浸洗片刻，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。用光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織中藍(lán)色區(qū)域?yàn)槟z原蛋白。Sirius red 染色：滴加 Sirius red 染液染色 1 h，用清水沖去切片表面的染色液體，保持干燥。用蘇木精染色細(xì)胞核 10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察紅色區(qū)域?yàn)槟z原蛋白。

1.4 原代心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及分組

取出生 1～3 d 的Wistar 大鼠心臟，將其剪碎，用胰蛋白酶消化 8 min，然后加入 DMEM 培養(yǎng)基以終止消化。在相同操作 8 次后，4℃ 下 800 r/min 離心 10 min 收集細(xì)胞。孵育 2 h 后，丟棄上層未附著的細(xì)胞；將附著的細(xì)胞(CFs)接種在培養(yǎng)皿中，使用含有 10% 胎牛血清(FBS)和 1% 青霉素或鏈霉素的 DMEM 在孵箱中培養(yǎng)。為了確保 CFs 的純度，將細(xì)胞傳至第三代后使用。將細(xì)胞按5×105cells/well接種于 10 cm 培養(yǎng)皿中，并隨機(jī)分成：正常對(duì)照組(Control)：用 DMEM(含5.5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)；高糖組(HG)：用含有高葡萄糖(40 mmol/L)的 DMEM 培養(yǎng)；精胺組(HG + Sp)：在 HG 前 30 min 在培養(yǎng)基中加入 5 μmol/L Sp 預(yù)處理。

1.5 CCK8檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞活力

按照實(shí)驗(yàn)分組，將心肌成纖維細(xì)胞接種于 96 孔板中，細(xì)胞密度為 5×103cells/well。設(shè)立空白對(duì)照組，加藥處理后在孵箱中培養(yǎng) 48 h，取出孔板用預(yù)冷 PBS 洗滌 3 次，把液體甩干后向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，避光在 37℃ 孵箱中孵育1 h，隨后取出孔板在 450 nm 波長范圍，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔的 OD值。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中 Collagen-I/-III 含量

各組分別培養(yǎng) 48 h 后，收集各組培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，4℃ 下 800 r/min 離心取上清液，分別加入 96 孔板中，設(shè)置 TMB 空白對(duì)照孔，并設(shè)置等比濃度的標(biāo)準(zhǔn)品孔和零孔，對(duì)應(yīng)加入標(biāo)準(zhǔn)品液 100 μl。每個(gè)待測(cè)孔內(nèi)分別加入樣品稀釋液 100 μl，用封板膜密封各孔，在 37℃ 溫箱中孵育 90 min 后取出孔板，洗板，甩干至干燥。每孔均加入 Collagen-I/-III 抗體工作液 100 μl 并用封板膜密封。37℃ 溫箱中孵育 90 min，洗板 3 次，甩干至干燥，每孔均加入 ABC 工作液 100 μl并用封板膜密封各孔。37℃ 孵育 30 min 后，洗板 5 次，甩干至干燥，加入 TMB 顯色液 90 μl，37℃ 避光孵育 20 min。每孔加入 TMB 終止液 100 μl，孔內(nèi)會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色或黃色，使用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 波長范圍每孔的OD值，測(cè)得 Collagen-I/-III 在 CFs 培養(yǎng)基上清液中的含量。

1.7 Western blot蛋白檢測(cè)

將各組加藥處理的細(xì)胞培養(yǎng)皿用 2 ml 預(yù)冷 PBS 沖洗 3 次，在每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)加入含有 1% PMSF 蛋白酶抑制劑和 RIPA 蛋白強(qiáng)效裂解液的混合液 2 ml，用刮刀收集到 EP 管中，4℃ 下細(xì)胞裂解 30 min 后，高速離心機(jī) 4℃ 下 13 500 r/min 速離心 25～30 min，取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白含量。SDS-PAGE 電泳分離蛋白，上樣，電泳，溴酚蘭抵達(dá)凝膠底部時(shí)停止電泳。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后，裁剪目的蛋白條帶。將目的條帶加入相應(yīng)的一抗(PCNA、CyclinD1、P27按 1∶ 1 000 配制)，4℃ 過夜。TBST 洗膜后,加入二抗(1∶10 000 配制)，室溫孵育 1 h。TBST 洗膜，ECL 法顯色。測(cè)量條帶灰度值，分析計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠血糖、胰島素和心臟功能相關(guān)指標(biāo)改變

與 Control 組相比，T1D 組大鼠血糖升高，胰島素水平、射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)明顯降低。與 T1D 組相比，精胺對(duì)血糖和胰島素水平影響不明顯，但是明顯改善 EF 和 FS(P<0.05，表1)。

Tab. 1 Changes of blood glucose,insulin and heart function related indicators in each n=8)

2.2 大鼠心臟膠原含量變化

Masson染色顯示：與 Control 組相比，T1D 組大鼠膠原表達(dá)量從(3.25±0.44)%增加為(15.15± 1.40)%；與 T1D 組相比，T1D+Sp 組膠原表達(dá)量下降到(7.06±0.88)%。Sirius red 染色顯示：Control 組、T1D 組和 T1D+Sp 組大鼠心肌組織的膠原表達(dá)量分別為(2.68±0.70)%、(14.52±1.68)%和 (6.05±1.13)%(P<0.05，圖1)。

Fig. 1 Masson and Sirius red staining of myocardial tissue in each group were observed by ordinary optical microscope(×40 QUOTE ×400)

2.3 心肌成纖維細(xì)胞的活力變化

與 Control 組相比，HG 組 CFs 活力顯著升高；與 HG 組相比，HG+Sp組細(xì)胞活力明顯下降(P< 0.05，表2)。

2.4 心肌成纖維細(xì)胞膠原分泌變化

與 Control 組相比，HG 組 CFs 培養(yǎng)基中 Collagen-I/-III 的含量明顯增加；與 HG 組相比，HG+Sp 組培養(yǎng)基中 Collagen-I/-III 的含量明顯下降(P< 0.05，表2)。

Tab. 2 Cell viability of CFs detected by CCK-8 and changes of Collagen-I/-III content in culture medium analyzed by n=6)

2.5 心肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白變化

分別以 PCNA、CyclinD1 和 P27 與 Actin 的比值作為觀察參數(shù)。與 Control 組相比，HG 組 PCNA 和 CyclinD1 表達(dá)增加，而 P27 的表達(dá)降低；與 HG 組相比，HG+Sp 組 PCNA 和 CyclinD1 表達(dá)下調(diào)，P27 顯著上調(diào)(P<0.05，圖2，表3)

Fig. 2 Comparison of cell cycle related protein in CFs

Tab. 3 Comparison of cell cycle related protein expressions in each n=6)

3 討論

血糖升高是糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，長期高血糖可引發(fā)糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)的發(fā)生。作為 DCM 主要特征之一的心肌纖維化可通過心肌間質(zhì)膠原過度沉積，導(dǎo)致心肌舒張和收縮功能障礙，最終發(fā)生心力衰竭[11]。本課題組前期研究證實(shí)，外源性精胺對(duì)高血糖性心肌損傷、心肌缺血/再灌注損傷、心肌肥大等心血管性疾病具有保護(hù)作用[6-10]。但是，精胺對(duì)糖尿病心肌纖維化的作用和相關(guān)機(jī)制尚未闡明。

本研究采用一次性腹腔注射 STZ 建立 T1D 大鼠模型，模型組大鼠血糖明顯升高，胰島素水平下降，說明模型復(fù)制成功；大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)明顯降低，而心肌膠原纖維沉積增加，提示大鼠發(fā)生了 DCM。給予精胺預(yù)處理可以減輕大鼠心功能障礙和膠原沉積，說明精胺改善 DCM 大鼠的心功能障礙與減輕膠原纖維沉積引起的心肌纖維化有關(guān)。

DCM的心肌纖維化以 CFs 增殖并大量分泌膠原蛋白為顯著特征，抑制 CFs 增殖成為減輕心肌纖維化的關(guān)鍵。本研究用 HG 處理 CFs 模擬體外模型，通過 CCK-8 檢測(cè) CFs 的活力，并用 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中膠原的含量。結(jié)果顯示，與 Control 組相比，HG 組 CFs 的活力和培養(yǎng)基中膠原含量顯著增加；精胺預(yù)處理可以減輕上述變化?？梢姡珻Fs 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述的大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

細(xì)胞周期在細(xì)胞增殖中起重要作用。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是細(xì)胞核中的 DNA 聚合酶輔助蛋白，在 DNA 合成期(特別是 G1 期到 S 期)中作用至關(guān)重要[12]。PCNA 也是細(xì)胞增殖的主要標(biāo)志物, 參與調(diào)控細(xì)胞周期和 DNA 復(fù)制過程[13]。CyclinD1 是控制靜止細(xì)胞從G0期再進(jìn)入 G1 期的關(guān)鍵因子，被認(rèn)為是一種原癌基因，其主要作用為促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。P27 是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可阻斷細(xì)胞周期的 G1-S 轉(zhuǎn)變[15]。CyclinD1 和 P27 相互作用，可以調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組 PCNA、CyclinD1 和 P27 的蛋白表達(dá)情況。與 Control 組相比，HG 組 PCNA 和 CyclinD1 表達(dá)顯著上調(diào)，P27 的表達(dá)下調(diào)；給予精胺預(yù)處理減輕上述的蛋白表達(dá)變化。這也提示，精胺可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制 CFs 的過度增殖，進(jìn)而減輕糖尿病心肌纖維化。

綜上所述，DCM 中 CFs 的異常增殖和膠原蛋白過度沉積是導(dǎo)致心肌纖維化的重要機(jī)制。給予精胺預(yù)處理，通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制糖尿病大鼠 CFs 的增殖能力和膠原沉積，改善心臟功能。精胺具有減輕糖尿病心肌病心肌纖維化的心臟保護(hù)作用，其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)為臨床防治 DCM 提供新靶點(diǎn)和新方法。