王一婷，劉明潔，王璐，關(guān)國(guó)平

東華大學(xué)紡織學(xué)院，紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海, 201620)

【關(guān)健詞】 絲素纖維; 人工韌帶; 表面改性; 細(xì)胞相容性; 可降解

0 引言

前交叉韌帶(AnteriorCruciateLigament,ACL)是膝關(guān)節(jié)的重要組成部分[1]，ACL本質(zhì)上是由滑膜包裹的致密結(jié)締組織，主要成分是膠原蛋白(I、Ⅱ和V型)。其中，I型膠原蛋白約占90%[2]，Ⅱ型和V型膠原約占10%。膠原纖維沿韌帶的長(zhǎng)軸平行排列，致密的結(jié)構(gòu)賦予韌帶足夠的強(qiáng)力以維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性。然而，由于各種原因?qū)е碌腁CL斷裂是臨床外科的常見(jiàn)病例[3]。人工韌帶移植是臨床治療韌帶斷裂的有效手段之一[4-6]。臨床上曾經(jīng)使用較多的人工韌帶是LARS(LigamentAdvancedReinforcementSystem)人工韌帶[7-11]，由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PolyethyleneTerephthalate,PET)復(fù)絲編織而成，具有良好的力學(xué)性能和生物學(xué)穩(wěn)定性。盡管如此，由于PET材料的不可降解性[12-15]，LARS人工韌帶植入體內(nèi)一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生疲勞松弛，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)。而且，長(zhǎng)期磨損后容易產(chǎn)生碎屑，甚至引發(fā)滑膜炎、骨關(guān)節(jié)炎等并發(fā)癥。因此，開(kāi)發(fā)一種生物相容性良好、可降解的人工韌帶材料就成為該領(lǐng)域重要的研究方向。

絲素纖維[16-19]具有良好的力學(xué)性能、可降解性和生物相容性，應(yīng)用于外科縫合線(xiàn)已有很長(zhǎng)的歷史。故用絲素纖維嘗試開(kāi)發(fā)一種高強(qiáng)、可降解的人工韌帶材料，具有很好的前景。本研究結(jié)合編織及機(jī)織的方法，以天然絲素纖維為原材料，首先，設(shè)計(jì)制備了一種結(jié)構(gòu)仿生的人工韌帶材料。換言之，內(nèi)部是平行排列的絲素纖維編織紗，外部包裹了一層絲素纖維機(jī)織材料。其次，采用具有促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖作用的生物活性分子對(duì)該材料進(jìn)行表面接枝改性[20-21]，包括I型膠原蛋白(ColI)、纖維蛋白原(Fg)和TGF-β1結(jié)合肽(Pep)。最后，對(duì)這些材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行了表征。期望本研究為開(kāi)發(fā)高強(qiáng)、可降解、細(xì)胞相容性良好的人工韌帶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然蠶絲； 無(wú)水碳酸鈉； 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基羰二亞胺； N-羥基琥珀酰亞胺； 2-嗎啉乙磺酸。CCK-8試劑盒； 人真皮成纖維細(xì)胞。精密電子天平； HD-300低溫等離子處理儀； HYG-B全溫?fù)u瓶柜； OCA15EC接觸角測(cè)試儀； 傅里葉紅外光譜儀掃描電子顯微鏡。常溫震蕩染色試驗(yàn)機(jī)； 環(huán)境掃描電子顯微鏡； 電熱鼓風(fēng)干燥箱酶標(biāo)儀。

1.2 絲素纖維人工韌帶材料的設(shè)計(jì)與制備[22-23]

通過(guò)參考天然韌帶結(jié)構(gòu)、鋼纜式結(jié)構(gòu)和帶芯紗編織結(jié)構(gòu)，本研究以一束平行排列的絲素編織紗作為“芯”，一層絲素纖維機(jī)織材料作為“殼”包裹在“芯”的外面，獲得仿生結(jié)構(gòu)的人工韌帶材料。

1.3 表面改性

對(duì)絲素纖維人工韌帶材料表面進(jìn)行低溫氧氣等離子體處理，設(shè)定參數(shù): 真空度為50 Pa，放電功率為10 W，處理 10 min。將氧等離子體處理后的絲素纖維人工韌帶材料浸泡在pH為6.0的2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液中，浴比為1:30, 室溫下反應(yīng)2 h。再往MES緩沖液中加入濃度為0.1 mmoL/L的EDC溶液30 mL，反應(yīng)2 h。再加入濃度為0.1 mmoL/L的NHS溶液30 mL繼續(xù)反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后將材料轉(zhuǎn)移入0.1 g/mL的Col I溶液中，4℃下反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后，將絲素纖維人工韌帶材料取出，用去離子水清洗3次，每次5 min。最后，把材料放入37 ℃烘箱中干燥后得到Col I接枝的絲素纖維人工韌帶材料(SF-O2-Col I)。同法制備Fg接枝的絲素纖維人工韌帶材料(SF-O2-Fg)和Pep接枝的絲素纖維人工韌帶材料(SF-O2-Pep)。

1.4 掃描電子顯微鏡(SEM)

采用TM 3000掃描電子顯微鏡對(duì)SF-O2-Col I、SF-O2-Fg和SF-O2-Pep進(jìn)行表面形貌觀察，實(shí)驗(yàn)前按要求使用導(dǎo)電膠將樣品固定于電鏡臺(tái)上并噴金，觀察時(shí)加速電壓為5 kV。

1.5 力學(xué)性能

利用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)試材料的力學(xué)性能。力學(xué)性能測(cè)試前，先將樣品置于恒溫恒濕 ( 溫度為20 ℃±2 ℃ ，相對(duì)濕度為65%±2% ) 環(huán)境中平衡 24 h，隔距40 mm，拉伸速率為20 mm/min，預(yù)張力為0.2 N，樣品重復(fù)數(shù)為3，結(jié)果取平均值。

1.6 材料表面水接觸角

測(cè)量?jī)x器為OCA15EC接觸角測(cè)試儀(德國(guó) Dataphysics)，測(cè)試方法采用氣泡法，測(cè)試液體為去離子水。試樣尺寸為 50 mm×10 mm，每個(gè)試樣取3個(gè)測(cè)試點(diǎn)，每組試樣測(cè)試 3個(gè)樣品，結(jié)果取平均值(n=9)。

1.7 傅里葉紅外光譜

采用Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，通過(guò)衰減全反射法(Attenuated total reflection，ATR)，對(duì)SF-O2-Col I、SF-O2-Fg以及SF-O2-Pep進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)表征，掃描范圍為500～4 000 cm-1。

1.8 細(xì)胞相容性

本研究采用人真皮成纖維細(xì)胞(HFF)對(duì)絲素纖維人工韌帶材料進(jìn)行細(xì)胞相容性表征。先將絲素纖維人工韌帶材料(SF)、SF-O2-Col I、SF-O2-Fg以及SF-O2-Pep制作成直徑為14 mm的圓形試樣。分別放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔一個(gè)試樣。將24孔板放入無(wú)菌操作臺(tái)，用紫外光照射24 h，用75%酒精浸泡材料30 min，再吸干酒精，用PBS清洗3次，每次10 min。每孔種植HFF的數(shù)量為8 000個(gè)，在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1 d、4 d、7 d、10 d，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔中加入50 μL的CCK-8試劑，在避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。結(jié)束后，將24孔板中的溶液轉(zhuǎn)移至96孔板，用MuLTISKAN MK3酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度，測(cè)試波長(zhǎng)為450 nm。從24孔板的一個(gè)孔中取100 μL溶液加入到96孔板的一個(gè)孔中，共取3次。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究的所有數(shù)據(jù)以“平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間數(shù)據(jù)的差異性檢驗(yàn)采用方差分析法，P<0.05為顯著差異(*) ，P<0.01為極顯著差異(**)。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素纖維人工韌帶材料形態(tài)結(jié)構(gòu)

制備的絲素纖維人工韌帶材料照片如圖3所示。該絲素纖維人工韌帶材料呈象牙白色，表面平整、結(jié)構(gòu)規(guī)整、紋理規(guī)則清晰。該人工韌帶的直徑約為6 mm(圖3A)。體視顯微鏡下可見(jiàn)，該絲素纖維人工韌帶材料表面結(jié)構(gòu)規(guī)則、致密，觀察不到內(nèi)部紗線(xiàn)，說(shuō)明包覆效果良好(圖3B)。由于機(jī)織“殼”的管徑可以根據(jù)需要任意調(diào)節(jié)，因此采用編織和機(jī)織相結(jié)合的方法可以獲得尺寸和力學(xué)性能精確控制的人工韌帶材料。

圖3 絲素纖維人工韌帶材料照片F(xiàn)ig.3 Silk fibroin fiber artificial ligament prototype

2.2 SEM

電子顯微鏡掃描(SEM) 結(jié)果如圖 4 所示。改性前，SF材料表面的絲素纖維光滑平整，纖維邊界清晰(圖4A)。通過(guò)膠原蛋白進(jìn)行表面改性后，材料表面出現(xiàn)了一層膜狀物(圖4B)。人纖維蛋白原處理后，纖維表面出現(xiàn)大量微小的點(diǎn)狀沉積物，亦可見(jiàn)較大的聚集體成團(tuán)塊狀或條狀，但沒(méi)有形成膜(圖4C)。TGF-β1結(jié)合肽處理后，纖維表面可見(jiàn)分布均勻的顆粒狀沉積物，但未見(jiàn)集聚團(tuán)塊和膜，纖維之間邊界仍然清晰可見(jiàn)(圖4D)。

圖4 韌帶材料SEM圖像 Fig.4 SEM micrographs of SF

2.3 力學(xué)性能

對(duì)絲素纖維人工韌帶材料SF、SF-O2-Col I、SF-O2-Fg及SF-O2-Pep的拉伸斷裂強(qiáng)度分別為(46.6±3.6) MPa、(45.5±2.6) MPa、(41.4±1.0) MPa和(43.1±0.7) MPa。如圖5所示。而“芯”的拉伸斷裂強(qiáng)度僅為(10.5±0.5) MPa。說(shuō)明機(jī)織套管在提高人工韌帶材料結(jié)構(gòu)緊密度和拉伸斷裂強(qiáng)度方面具有顯著作用。而且，四種絲素纖維人工韌帶材料的拉伸斷裂強(qiáng)度之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，均接近真實(shí)ACL的拉伸斷裂強(qiáng)度。值得一提的是，本研究設(shè)計(jì)制備的這種人工韌帶材料的明顯優(yōu)勢(shì)是，可對(duì)其尺寸和力學(xué)性能進(jìn)行可控調(diào)節(jié)。

圖5 絲素纖維人工韌帶材料的拉伸斷裂強(qiáng)度Fig.5 Tensile strengths at break of four artificial ligament materials

2.4 水接觸角

對(duì)改性前后的試樣進(jìn)行水接觸角測(cè)試，結(jié)果如表1所示。絲素纖維人工韌帶材料SF的表面水接觸角是64.6°±0.2°，而SF-O2-Col I、SF-O2-Fg和SF-O2-Pep的水接觸角分別是59.2°±0.1°、62.5°±0.2°和63.4°±0.2°。改性前后絲素纖維人工韌帶材料表面的水接觸角沒(méi)有明顯變化。這可能由于絲素纖維材料本身的親水性本質(zhì)有關(guān)，故改性后的材料表面水接觸角與改性前接近。

表1 絲素纖維人工韌帶材料的水接觸角(°)Tab.1 Water contact angles of four artificial ligament materials

2.5 紅外光譜

表面改性前后的絲素纖維人工韌帶材料的FTIR紅外光譜如圖6所示。絲素蛋白(SF)中的酰胺Ⅰ和酰胺 Ⅱ特征峰分別出現(xiàn)在1 620 cm-1和1 513 cm-1的位置，酰胺Ⅲ吸收峰出現(xiàn)在1 228 cm-1位置。如圖所示，改性后各人工韌帶材料的分子結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，未見(jiàn)破壞。說(shuō)明低溫等離子體處理聯(lián)合分子接枝的方法十分溫和，不會(huì)對(duì)絲素纖維材料造成結(jié)構(gòu)上的損傷。該結(jié)果也與力學(xué)性能測(cè)試結(jié)果相符，經(jīng)過(guò)改性后的材料的力學(xué)性能未有顯著變化。

圖6 絲素纖維人工韌帶材料的紅外光譜測(cè)試結(jié)果Fig.6 FTIR spectra of four artificial ligament materials

2.6 細(xì)胞相容性

絲素纖維人工韌帶材料細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果，如圖7所示。圖中的CONTROL為陰性對(duì)照(培養(yǎng)板)，SF、SF-O2-Col I、SF-O2-Fg及SF-O2-Pep為實(shí)驗(yàn)組。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，所有材料表面的細(xì)胞數(shù)量均逐漸增加。培養(yǎng)4 d后，SF-O2-Fg表面細(xì)胞活性已經(jīng)顯著高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)Fg接枝后的材料表面非常有利于HFF的粘附和增殖。這與周曉梅等的研究一致。而其他三個(gè)樣品的OD值仍然低于陰性對(duì)照組。培養(yǎng)7 d后的試驗(yàn)結(jié)果與4 d的結(jié)果相似，SF-O2-Fg材料的細(xì)胞相容性仍然表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。培養(yǎng)10 d后，SF-O2-Pep組的OD值有了較明顯的增加，雖然低于SF-O2-Fg組，但是與陰性對(duì)照組之間已經(jīng)沒(méi)有顯著差異。Fg可以通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞非整合素受體結(jié)合而與細(xì)胞相互作用，產(chǎn)生趨化作用，促進(jìn)細(xì)胞粘附增殖。Fg也促進(jìn)了HFF真皮成纖維細(xì)胞的增殖。這是韌帶修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。

圖7 絲素纖維人工韌帶材料的細(xì)胞活性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of cell viability of four artificial ligament materials

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)并制備了一種可降解的絲素纖維人工韌帶材料，結(jié)合編織及機(jī)織的方法可獲得與天然韌帶相似的仿生結(jié)構(gòu)。通過(guò)O2等離子體處理及化學(xué)接枝，對(duì)該絲素纖維人工韌帶材料表面進(jìn)行了改性。結(jié)果表明，表面接枝生物分子可改變絲素纖維人工韌帶材料的表面微形貌。然而，由于天然絲素纖維材料表面顯示親水性，表面改性后的水接觸角并沒(méi)有發(fā)生明顯改變。本研究所采的表面改性方法對(duì)絲素纖維人工韌帶材料的分子結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能影響不大，改性后材料的拉伸斷裂強(qiáng)度仍然滿(mǎn)足作為ACL移植物的拉伸斷裂強(qiáng)度要求。細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明，表面改性處理對(duì)提高絲素纖維人工韌帶材料的細(xì)胞相容性有積極影響。其中，SF-O2-Fg組材料的細(xì)胞相容性表現(xiàn)最優(yōu)。這可能提示，與ColI和Pep相比較，F(xiàn)g對(duì)成纖維細(xì)胞的粘附增殖更為有利。此外，本研究所設(shè)計(jì)的這種人工韌帶材料的明顯優(yōu)勢(shì)在于其結(jié)構(gòu)、尺寸和力學(xué)性能的可控性。

致謝

感謝東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院婁向新老師、郜增在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分的幫助。