王鑫蕾 倪曉晴 蘇建友 袁瑾 趙小芹 周冉冉 崔世維 蔣燕秋 顧云娟

南通大學(xué)附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2老年醫(yī)學(xué)科，3檢驗科（南通226001）

肝臟是維持機體糖脂代謝平衡的重要器官，肝臟胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用[1-2]。當肝臟發(fā)生胰島素抵抗時，肝細胞胰島素受體及其底物的酪氨酸磷酸化程度下降，從而導(dǎo)致肝臟糖原異生及肝糖輸出增加[3]。脂肪肝與肝臟胰島素抵抗關(guān)系密切，而高脂飲食是脂肪肝的重要病因之一[4]。研究表明，限熱卡高脂飲食能有效的改善機體糖脂代謝[5]，減少肝臟脂肪含量，降低肝臟糖異生基因PEPCK及G6Pase的表達而增強胰島素信號傳導(dǎo)，減少肝糖異生[6]。然而限熱卡高脂飲食對機體肝糖異生及肝臟胰島素抵抗影響的作用機制尚未明確。

AKT/FOXO1是胰島素調(diào)節(jié)肝臟糖原異生及肝糖輸出的信號通路之一[7]，當胰島素與肝細胞表面的胰島素受體特異性結(jié)合，激活胰島素受體底物（IRS），使下游PI3K/AKT信號通路活化，下游轉(zhuǎn)錄因子FOXO1 磷酸化而致其由細胞核排斥至細胞質(zhì)[8]，從而阻斷下游糖異生基因（PEPCK和G6Pase）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，致肝臟糖原異生及肝糖輸出減少[9]，而限熱卡高脂飲食是否通過信號通路AKT/FOXO1對肝糖異生及相關(guān)下游基因起作用尚未明確。本研究將對高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖小鼠進行不同程度的限熱卡高脂飲食干預(yù)，探討信號通路AKT/FOXO1 在限熱卡高脂飲食改善小鼠肝糖異生及肝臟胰島素抵抗中所起的作用，為臨床使用限熱卡高脂飲食方案治療脂肪肝患者提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料4周齡雄性C57BL/6J小鼠35只體質(zhì)量（20.3±1.8）g 購自南京市江寧區(qū)青山動物繁殖場。飼料購自北京科奧生物科技有限公司，高脂飼料：基礎(chǔ)料73.8%，其中玉米等能量飼料占20%，豬油15%，蛋黃10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%；高脂低熱量飼料：基礎(chǔ)料73.8%，其中玉米等能量飼料占10%，粗纖維占10%，豬油15%，蛋黃10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%；高脂極低熱量飼料：基礎(chǔ)料73.8%，其中玉米等能量飼料占0%，粗纖維占20%，豬油15%，蛋黃10%，膽固醇1%，膽鹽0.2%。

1.2 動物飼養(yǎng)及分組35只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機處死5只小鼠作為基線對照。對照組（n=10）以標準飼料喂養(yǎng)，高脂組（n=20）以高脂飼料喂養(yǎng)，12周后，兩組隨機處死小鼠各5只。對照組繼續(xù)以標準飼料喂養(yǎng)，實驗組則隨機分為繼續(xù)高脂組（Continue high fat diet，CHFD組，n=5）、低熱卡高脂組（low calorie high fat diet，LCHFD組，n=5）、極低熱卡高脂組（very low calorie high fat diet，VLCHFD組，n=5），12周后處死。小鼠均自由進水，每周稱重一次，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為（25±1）℃，相對濕度30%～40%，12 h 交替照明。

1.3 標本收集與處理于飼養(yǎng)0、12、24 周對空腹12 h的小鼠進行采血或處死。小鼠采血時采用套管針自腹主動脈采血，緩慢抽血至5～7 mL 以上，3 000 r/min 離心15 min，取上清，-80℃冰箱保存。小鼠處死后取肝臟，稱重。部分肝臟用等滲鹽水清洗后置于-80℃冰箱凍存，部分肝臟用4%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片。

1.4 生化指標測定使用日立7170 全自動生化分析儀以酶法測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、空腹血糖（FPG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）。空腹胰島素（FINS）以放射免疫法檢測，試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.5 胰島素抵抗評估HOMO-IR= FPG（mmol/L）×FINS（mIU/L）/22.5[10]。

1.6 肝臟組織病理肝臟組織切片HE染色及油紅染色，觀察肝細胞脂肪浸潤情況。

1.7 Real-time PCR檢測mRNA表達量Trizol 提取總RNA，各取5 μL RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，再分別取5 μL cDNA 進行實時聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time PCR）。根據(jù)GenBank 設(shè)計引物，F(xiàn)OXOl 上、下游引物序列分別為：5′-GCATCCATGGACAACAACAG-3′和3′-TGATGGTGCTAGCGTTTGAG-5′；PEPCK 上下游引物分別為5′-GTTCAATGCCAGGTTCCCAG-3′和3′-TTGCAGGGCCAGTTGTTGAC-5′；G6Pase 上、下游引物序列分別為：5′-TGGTTGGGATTCTGGGCTGT-3′和3′-TCTACACCCAGTCCCTTGAG-5′；以β-actin為內(nèi)參，上、下游引物序列分別為：5′-TGTGATGGTGG-GAATGGGTCAG-3′和3′-TTTGATGTCACGCACGA-TTTCC-5′，基因表達水平以2-ΔΔCt法進行計算。

1.8 Western blot測蛋白表達量檢使用Western blot小鼠肝臟組織中FOXO1、p-FOXO1、AKT及p-AKT的表達水平。小鼠處死后分離部分肝組織，勻漿離心后取上清，考馬斯亮藍測定蛋白濃度。灌膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗及二抗后顯影，采用凝膠圖像成像分析儀灰度掃描定量分析，以β-actin為內(nèi)參?？贵w購自Santa Cruz 生物有限公司。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示。組內(nèi)比較采用單因素方差分析，兩組比較使用q檢驗，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 限熱卡高脂飲食對小鼠體質(zhì)量的影響CON組與HFD組小鼠從喂養(yǎng)開始，體質(zhì)量均逐漸增加，至喂養(yǎng)第4 周HFD組小鼠與CON組小鼠體質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，至喂養(yǎng)第8周及第12周，HFD組小鼠體質(zhì)量顯著高于對照組（均P＜0.001）（圖1A）。

喂養(yǎng)第12周后，CON組繼續(xù)以標準飼料喂養(yǎng)，實驗組則隨機分為CHFD組、LCHFD組及VLCHFD組繼續(xù)喂養(yǎng)12周，至喂養(yǎng)第24周，CHFD組小鼠體質(zhì)量顯著高于CON組（P＜0.001），盡管CHFD組、LCHFD組、VLCHFD組三組小鼠體質(zhì)量逐漸下降，但LCHFD組體質(zhì)量顯著高于CON組（P＜0.001），而VLCHFD組小鼠體質(zhì)量與CON組小鼠體質(zhì)量相比則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1B）。

圖1 各組小鼠喂養(yǎng)過程中的體質(zhì)量變化及比較Fig.1 Weightchangesand comparisons offourgroups during the feeding process

2.2 限熱卡高脂飲食對小鼠生化指標的影響喂養(yǎng)24周后，CHFD組小鼠FPG、ALT、TC及TG顯著高于CON組（均P＜0.05），僅VLCHFD組FPG 與CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而FPG、ALT、TC及TG 在CHFD組、LCHFD組及VLCHFD組均逐漸下降，且LCHFD組及VLCHFD組分別與CHFD組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。

表1 喂養(yǎng)24周后四組小鼠生化指標及胰島素抵抗程度的比較Tab.1 The comparisons of biochemical indices and insulin resistance of four groupsat 24-week ±s

表1 喂養(yǎng)24周后四組小鼠生化指標及胰島素抵抗程度的比較Tab.1 The comparisons of biochemical indices and insulin resistance of four groupsat 24-week ±s

注：與CON組比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與CHFD組比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

ALT（U/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）FPG（mmol/L）FINS（mIU/L）HOMA-IR（mIU·mmol/L2）CON 21.35±3.01 1.71±0.14 0.72±0.07 4.83±0.28 2.73±0.11 0.64±0.03 CHFD 47.04±5.23***3.43±0.65**1.84±0.11**11.98±0.34***5.82±0.16**3.10±0.08**LCHFD 37.90±4.45**##3.13±0.27**#1.35±0.06**#8.25±0.47**#4.07±0.13**#2.67±0.10**VLCHFD 33.21±4.11***#2.81±0.35**##1.23±0.46**#4.56±0.15###3.07±0.06*##1.49±0.07*#

2.3 限熱卡高脂飲食對小鼠胰島素抵抗程度的影響喂養(yǎng)24周后，CHFD組小鼠FINS、HOMA-IR 顯著高于CON組（均P＜0.01），而FINS、HOMA-IR 在CHFD組、LCHFD組及VLCHFD組 均 逐 漸 下 降。LCHFD組及VLCHFD組的FINS分 別與CHFD組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），而HOMAIR 僅VLCHFD組與CHFD組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.4 限熱卡高脂飲食對小鼠肝細胞脂肪浸潤的影響喂養(yǎng)24周后，四組小鼠肝臟組織HE染色（圖2）及油紅染色（圖3）均結(jié)果表明，CHFD組小鼠肝細胞脂肪空泡變性程度顯著，LCHFD組及VLCHFD組小鼠肝細胞脂肪空泡變性程度逐漸下降且改善明顯。

2.5 限熱卡高脂飲食對小鼠肝臟糖異生基因表達的影響喂養(yǎng)24周后，CHFD組小鼠Foxo1、Pepck及G6p-ase的基因表達顯著高于CON組（均P＜0.001），而VLCHFD組Foxo1及G6p-ase的基因表達與CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Foxo1、Pepck及G6p-ase的基因表達在CHFD組、LCHFD組及VLCHFD組均逐漸下降，且LCHFD組及VLCHFD組的上述基因表達均顯著低于CHFD組（均P＜0.001，圖4）。

圖2 喂養(yǎng)24周后四組小鼠肝臟組織HE染色Fig.2 Hematoxylin-eosin staining of mice liver tissues at 24-week

圖3 喂養(yǎng)24周后四組小鼠肝臟組織油紅染色Fig.3 Oil red staining of mice liver tissues at 24-week

圖4 喂養(yǎng)24周后四組小鼠肝臟糖異生基因表達的比較Fig.4 The comparisons of expressionsof genes about hepatic gluconeogenesis in four goups miceat 24-week

2.6 限熱卡高脂飲食對小鼠信號通路AKT/FOXO1磷酸化的影響喂養(yǎng)24周后，CHFD組小鼠p-FOXO1表達水平下降，p-FOXO1/FOXO1 降低，與CON組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），隨著熱卡限制的增加，CHFD組、LCHFD組及VLCHFD組p-FOXO1/FOXO1 逐漸增高，VLCHFD組與CON組相比P＞0.05，LCHFD組、VLCHFD組與CHFD組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。而p-AKT/AKT的表達水平CHFD組較之CON組顯著下降（P＜0.05），隨著熱卡限制的增加，CHFD組、LCHFD組及VLCHFD組逐漸增高，LCHFD組與CON組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LCHFD組、VLCHFD組與CHFD組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，圖5）。

3 討論

脂肪肝與肝臟胰島素抵抗密切相關(guān)，非酒精性脂肪肝是脂肪肝病因分型之一，且是目前最常見的慢性肝臟疾病[11]。當肝臟游離脂肪酸酯化合成甘油三酯超過肝臟甘油三酯分解代謝，形成極低密度脂蛋白時，非酒精性脂肪肝逐漸形成[12]。高脂飲食致肝內(nèi)甘油二酯增加，甘油二酯作為第二信使激活蛋白激酶Cε，使胰島素受體激酶減少，從而導(dǎo)致胰島素激活I(lǐng)RS的酪氨酸磷酸化水平下降，引起肝糖原合成及肝糖輸出增加[13]。因而高脂飲食不僅是非酒精性脂肪肝的重要誘因，也是肝臟胰島素抵抗形成的重要因素[14]。該實驗中，通過高脂飲食喂養(yǎng)將非酒精性脂肪肝小鼠造模成功，且脂肪肝小鼠出現(xiàn)了糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗程度升高。肝臟糖原合成、分解及肝糖輸出是調(diào)節(jié)機體空腹血糖水平重要因素之一[15]，該實驗中隨著小鼠飼養(yǎng)熱卡逐漸減少，小鼠肝細胞脂肪變性程度逐漸減輕，小鼠空腹血糖、血脂均逐漸降低。HOMA模型利用空腹血糖及胰島素評估空腹狀態(tài)胰島素敏感性及胰島β細胞功能，而空腹血糖及胰島素之間的關(guān)系主要反映了肝糖輸出與胰島β細胞功能的關(guān)系，故而HOMA-IR 能在一定程度反映肝臟胰島素抵抗[16]，該實驗中隨著小鼠飼料熱卡的逐漸減少，HOMA-IR 逐漸下降，提示小鼠肝臟胰島素抵抗逐漸改善。

圖5 喂養(yǎng)24周后四組小鼠肝臟信號通路AKT/FOXO1 蛋白定量的比較Fig.5 The comparisons of protein quantificationsof hepatic AKT/FOXO1signal pathwayin four groups miceat 24-week

調(diào)整飲食成分是非酒精性脂肪肝有效且可長期持續(xù)的治療方法[17]，限熱卡飲食即為有效的飲食干預(yù)方法之一，限熱卡飲食不僅能控制體質(zhì)量[18]，也能有效逆轉(zhuǎn)非酒精性脂肪肝[19]，而熱卡限制的低碳水化合物高脂飲食與傳統(tǒng)的熱卡限制的低脂飲食相比，對肝內(nèi)脂肪含量下降的作用相似[20]，該實驗中采用的限熱卡高脂飲食不僅使小鼠體質(zhì)量下降，糖脂代謝紊亂改善，且隨著熱卡減少，小鼠肝細胞脂肪變性程度逐漸減輕，轉(zhuǎn)氨酶下降，這與以往研究結(jié)果是相符的[20]。

本研究通過對高脂飲食喂養(yǎng)成功的非酒精性脂肪肝小鼠進行限熱卡高脂飲食干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)隨著攝入熱卡不同程度的減少，小鼠體質(zhì)量、血糖、血脂、脂肪肝空泡變性的程度及胰島素抵抗程度逐漸改善，與此同時，LCHFD組及VLCHFD組小鼠FOXO1、PEPCK及G6Pase 基因表達水平亦逐漸下降，而AKT及FOXO1 蛋白磷酸化則水平逐漸升高，上述結(jié)果表明AKT/FOXO1信號通路在肥胖小鼠限熱卡高脂飲食改善肝臟胰島素抵抗中的起到一定程度的作用。根據(jù)以往研究，限熱卡高脂飲食通過AKT/FOXO1信號通路改善肝臟胰島素抵抗主要機制如下：（1）限熱卡飲食促進體內(nèi)糖脂分解及利用，使PI3K/AKT信號通路活化，從而使轉(zhuǎn)錄因子FOXO1 磷酸化阻斷下游糖異生基因PEPCK及G6Pase的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，使肝臟糖原異生及肝糖輸出減少[9，21]，本研究結(jié)果與該機制相符。（2）肥胖和糖尿病機體線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘發(fā)氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加，導(dǎo)致肝臟、骨骼肌及脂肪組織胰島素抵抗[21-22]，促進并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[23]，當熱量限制后，由肝臟合成依賴于FOXO1的抗氧化蛋白，如SOD表達增加[24]，改善肝臟胰島素抵抗[25]。故而，本實驗中限熱卡高脂飲食也可能通過激活A(yù)KT/FOXO1信號通路改善肥胖小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)而增加肝臟胰島素敏感性。

本研究初步明確了信號通路AKT/FOXO1 在限熱卡高脂飲食改善小鼠肝糖異生及肝臟胰島素抵抗中具有重要作用，但抑制信號通路AKT/FOXO1后，限熱卡高脂飲食肥胖小鼠肝糖異生及肝臟胰島素抵抗的變化尚未明確，也是本實驗的局限之處。在后續(xù)研究中，課題組將通過PI3K/AKT/FOXO1信號通路抑制劑及肝臟特異性敲除FOXO1 基因小鼠，進一步闡明AKT/FOXO1信號通路在限熱卡高脂飲食對小鼠肝臟胰島素抵抗所起的作用。

綜上所述，限熱卡高脂飲食不僅能有效的控制肥胖小鼠的體質(zhì)量、血糖及血脂，也能有效地逆轉(zhuǎn)肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝，減少肝糖異生，改善肝臟胰島素抵抗，而AKT/FOXO1信號通路在這一過程中起到了重要作用。