樊凱 張海嚴(yán) 蔡道章

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（廣州510360）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見的關(guān)節(jié)炎形式，主要累及膝和（或）髖關(guān)節(jié)；OA的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括年齡、性別、肥胖等[1]。其病理改變主要有關(guān)節(jié)軟骨的破壞、軟骨下骨的硬化、骨贅的形成、滑膜炎癥和韌帶的降解等，共同導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)的疼痛和功能障礙[2]。但最近研究表明，在關(guān)節(jié)軟骨破壞的早期就有滑膜炎的存在，并導(dǎo)致患OA 風(fēng)險的增加[3]。急性、亞急性及慢性損傷導(dǎo)致最初關(guān)節(jié)軟骨的破壞，軟骨降解產(chǎn)物誘發(fā)了滑膜的局部炎癥反應(yīng)，后者促進(jìn)軟骨的進(jìn)一步破壞，形成惡性循環(huán)[4]。故關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥的存在是促進(jìn)OA 軟骨損傷及維持OA 病程進(jìn)展的重要原因[5]。

正五聚蛋白3（PTX3）是一種急性炎癥蛋白，該蛋白質(zhì)與血清淀粉陽蛋白質(zhì)A和C反應(yīng)蛋白同屬于一個蛋白家族，PTX3是主要由中性粒細(xì)胞、樹突樣細(xì)胞等分泌[6]。它在炎癥反應(yīng)中扮演著重要的作用，比如微生物的感染、動脈粥樣硬化等，可激活補體等方式對激素和炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]。在一些急性感染性疾病中，PTX3和CRP 可作為血液中的標(biāo)志物來對其進(jìn)行監(jiān)測，在一定程度上可直接反應(yīng)血管炎癥的狀態(tài)[8]。以上說明PTX3 可以參與到炎癥反應(yīng)中，且扮演著重要的作用；有大量臨床研究表明，關(guān)節(jié)炎患者的血液中和滑膜液中的PTX3的含量顯著提高[9]，但國內(nèi)外未有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，PTX3 對骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響。故本文對PTX3在骨性關(guān)節(jié)炎中的相互作用做探索，探究相互之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器IL-1β（美國Peprotech）；抗PTX3克隆抗體（美國Peprotech）；抗基質(zhì)金屬蛋白酶-13抗體（美國abcam）；抗Ⅱ型膠原抗體（美國abcam）；DAB 顯色劑（中國中杉金橋）；番紅O 粉末（美國Sigma）；固綠染劑（美國Sigma）；蘇木素粉劑（美國Sigma）；伊紅粉劑（美國Sigma）；石蠟包埋機(jī)（德國Leicarm）；石蠟切片機(jī)（德國Leicarm）；光學(xué)顯微鏡（德國Zeiss）；超速離心機(jī)（中國Legendmicro）。

1.1.2 人源膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本膝骨關(guān)節(jié)炎與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎軟骨標(biāo)本來自全膝關(guān)節(jié)置換的患者（n=5）。五年內(nèi)患有惡性腫瘤、糖尿病以及其他一些嚴(yán)重慢性病的患者不在選擇之內(nèi)，本研究中所篩選的膝骨關(guān)節(jié)炎均因退行性骨關(guān)節(jié)病變引起。所有樣本均取自南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科。

1.2 方法

1.2.1 佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（adjuvant induced arthritis，AIA）模型的建立10只C57/BL6 雄性小鼠，體質(zhì)量（20.0±1.7）g，年齡（8.0±0.7）周，雄性小鼠均購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。隨機(jī)分為實驗組和對照組，每組各5只，其中實驗組進(jìn)行AIA 建模，而對照組則進(jìn)行假手術(shù)。實驗組小鼠第0天，將完全弗氏佐劑皮下注射到小鼠的內(nèi)側(cè)腋窩中。兩周后膝關(guān)節(jié)中注射不完全弗氏佐劑。這種關(guān)節(jié)炎模型被廣泛用作小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的模型。術(shù)后6周后處死小鼠收集標(biāo)本。

1.2.2 內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)（destabilization of the medial meniscus，DMM）骨關(guān)節(jié)炎模型的建立DMM實驗組（n=5）和NC 假手術(shù)組（n=5）。其中實驗組麻醉小鼠固定其右膝關(guān)節(jié)，切開皮膚、膝關(guān)節(jié)囊，進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板離斷手術(shù)后縫合。術(shù)后肌肉注射青霉素防止感染。而NC組為假手術(shù)組不進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板離斷手術(shù)，僅剖開關(guān)節(jié)囊后逐層縫合，其余操作相同。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色、甲苯胺藍(lán)染色和蘇木素＆伊紅（HE）染色（1）免疫組織化學(xué)：常規(guī)脫蠟水，雙氧水處理15 min 修復(fù)后，封閉血清1 h，再用一抗4℃孵育過夜。第二天用二抗37℃孵育1 h后顯色。（2）甲苯胺藍(lán)（Toluidine blue，TB）染色：常規(guī)脫蠟水化，甲苯胺藍(lán)染液染后洗滌，隨后晾干透明樹脂封片，在顯微鏡下觀察染色情況。（3）蘇木素＆伊紅（HE）染色：常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色沖洗，分化液分化；再用伊紅染色，隨后晾干透明封片。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)軟骨前細(xì)胞系A(chǔ)TDC5（日本Tsukuba）在DMEM/F12（美國Gibco）中用10%FBS（美國Gibco），在37℃，5%CO2下維持。用IL-1β（美國Sigma）處理細(xì)胞24 h 以模擬體外OA。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗siRNA oligo 基因序列分別是：sense（5′-3′）GCACAAAGAGGAAUCCAUATT；antisense（5′-3′）UAUGGAUUCCUCUUUGUGCTT，分四組，分別為NC組、IL-1β組、IL-1β+siCon組和IL-1β+siPTX3組。IL-1β+siCon組和IL-1β+siPTX3組分別加入siCon和siPTX3的溶液2 μL，并加入含Lipofectamine 2000 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，4 h后換液，然后后三組加入10 ng/mL IL-1β，NC組則加入等量的培養(yǎng)基。

1.2.6 蛋白印跡實驗（Western blot）使用RIPA裂解細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。將樣品上樣到電泳凝膠孔中進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完后，將膜在封液中封閉。再與一抗4℃孵育過夜。次日，用二抗在37℃下孵育2 h后進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析分析對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性分析，并通過獨立樣本t檢驗分別對各組實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床軟骨標(biāo)本PTX3、MMP13的表達(dá)OA患者軟骨切片HE染色和甲苯胺藍(lán)（TB）染色顯示透明軟骨細(xì)胞減少，厚度變薄，表面粗糙，纖維化有破損；RA患者軟骨切片HE染色軟骨水腫，軟骨組織絨毛狀部分纖維化；免疫組化結(jié)果顯示OA組與RA組的軟骨中PTX3的表達(dá)較NC組增多（P＜0.001），同樣在OA組與RA組中MMP13表達(dá)較NC組上調(diào)（P＜0.000 1）。見圖1。

2.2 疾病模型小鼠中PTX3、MMP13的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，相對于NC組，PTX3蛋白在DMM組關(guān)節(jié)軟骨面中的表達(dá)相對于NC組明顯升高（P＜0.000 1）。在DMM 軟骨層中MMP13蛋白表達(dá)較NC組和AIA組亦增多（P＜0.001）。見圖2。

圖1 NC組、OA組與RA組的PTX3、MMP13的表達(dá)Fig.1 Expression of PTX3 and MMP13 in NC，OA and RA group

2.3 IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞后COL2、MMP13、PTX3的表達(dá)IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞ADTC5 24 h后，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的COL2蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），MMP13蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.001），且PTX3蛋白也隨之上調(diào)（P＜0.000 1）。而在48 h組中發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞的COL2蛋白表達(dá)減少更為明顯（P＜0.001），且MMP13蛋白與PTX3蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多（P＜0.000 1）。見圖3。

圖2 NC組、DMM組與AIA組的PTX3、MMP13的表達(dá)Fig.2 Expression of PTX3 and MMP13 in NC,DMM and AIA group

2.4 干擾PTX3表達(dá)后細(xì)胞合成與降解指標(biāo)的表達(dá)轉(zhuǎn)染干擾PTX3的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上用IL-1β誘導(dǎo)建立OA細(xì)胞模型，干擾PTX3后發(fā)現(xiàn)，IL+siPTX3組的COL2的表達(dá)較IL+siNC組增多且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且IL+siPTX3組MMP13的表達(dá)有所減少（P＜0.05）。見圖4。

圖3 IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞后COL2、MMP13、PTX3的表達(dá)Fig.3 Expression of COL2、MMP13 and PTX3 in ADTC5 cells treated with IL-1β

圖4 ADTC5 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的COL2，MMP13 and PTX3表達(dá)Fig.4 Expressions of COL2，MMP13 and PTX3 of ADTC5 cells after cell transfection

3 討論

目前骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因與機(jī)制均尚未明確，臨床上亦無有效的預(yù)防和非手術(shù)根治的方法，對于晚期的OA患者，唯有通過關(guān)節(jié)置換術(shù)給與治療以矯正畸形、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動度和緩解疼痛[10]。隨著中國老齡化的加重，OA患者也逐年增多，而骨性關(guān)節(jié)炎以高致殘率為典型特點，給社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)壓力同時，在面對單純手術(shù)選擇時且患者帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)[11-12]。

PTX3是一種比較常見的急性炎性蛋白，在感染、炎癥和腫瘤等方面具有重要的作用[13-14]，例如當(dāng)組織受到損傷或感染時，通過激活補體等方式對激素和炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而對因炎癥損傷的組織進(jìn)行修復(fù)[15]。在低度炎癥的環(huán)境中，如肥胖，衰老等狀態(tài)時，正五聚蛋白3 往往表現(xiàn)出升高趨勢[16-17]，側(cè)面說明該蛋白在促進(jìn)炎癥的發(fā)生中起到了重要的作用。

本研究結(jié)果顯示，PTX3在關(guān)節(jié)炎組織的軟組織中具有高表達(dá)性，這也表明了PTX3 可能與OA的發(fā)展具有密切的關(guān)系；利用IL-1β誘導(dǎo)ADTC5的細(xì)胞模型上，檢測PTX3 與相關(guān)合成分解代謝指標(biāo)COL2、MMP13，驗證PTX3在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)；通過使用小干擾siRNA 敲減經(jīng)由IL-1β 誘導(dǎo)的ADTC5 細(xì)胞上的PTX3蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其分解指標(biāo)MMP13蛋白表達(dá)減少，COL2表達(dá)增多。實驗結(jié)果表明，干擾PTX3 基因可減少細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，從而減慢軟骨基質(zhì)的退變。

以上說明，PTX3 可能在OA的發(fā)生發(fā)展中，起到了一定的促進(jìn)作用，可將PTX3 作為OA的潛在治療靶點，為OA 病理發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究以及OA的臨床預(yù)防和治療提供全新的理論依據(jù)。