張清偉 宋佳玉 孫明振 于江華 王慧芬 付秀虹

1漯河市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（河南漯河462000）；2漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系（河南漯河462000）

高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌的首要病因[1]，但大多數(shù)的HPV感染為一過性，僅少部分高危型HPV 持續(xù)感染導(dǎo)致宮頸病變[2]。同時(shí)不同地區(qū)與不同人群之中感染的HPV型別也存在較大差別[3]，具有區(qū)域性特點(diǎn)。因此尋找區(qū)域內(nèi)與HPV感染和轉(zhuǎn)歸相關(guān)指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)HPV 預(yù)后、宮頸疾病發(fā)生有著重要的意義。

機(jī)體免疫狀態(tài)、遺傳易感性等因素可能是宿主感染HPV后轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵所在[4]。目前認(rèn)為基因的單核甘酸多態(tài)性（polymorphisms，SNP）和特定SNP組合是影響疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)歸的重要原因之一[5]。抗原呈遞通路在病毒的免疫監(jiān)視中具有重要地位，影響宿主免疫狀態(tài)和疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。低分子量蛋白酶體（low molecular weight polypeptide，LMP）[7]、抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體（transporter associated with antigen processing，TAP）[8]、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）DQ[9]做為HLA抗原呈遞通路的關(guān)鍵位點(diǎn)，其基因位點(diǎn)的多態(tài)性影響宿主免疫狀態(tài)且和多種病毒感染相關(guān)[10-12]，但目前尚無與宮頸高危型HPV感染相關(guān)的報(bào)道。農(nóng)村居住地人口相對(duì)穩(wěn)定、人群間生活方式及遺傳背景較一致，選擇農(nóng)村婦女為研究對(duì)象更能突出地域性特點(diǎn)。作者故選取我市農(nóng)村婦女做為研究對(duì)象，檢測(cè)相關(guān)位點(diǎn)并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探討其相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象采用分層整群隨機(jī)抽樣法選取漯河市三區(qū)兩縣為抽樣地區(qū)，按2016年農(nóng)村適齡篩查女性人口比例分配各區(qū)（縣）調(diào)查村莊數(shù)量，各區(qū)（縣）隨機(jī)整群抽取村莊，以該村所有適齡婦女作為篩查對(duì)象進(jìn)行宮頸高危型HPV 篩查。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡25～65歲，性生活史＞3年；月經(jīng)干凈三天以上；取樣前72 h 無性生活及陰道用藥；排除標(biāo)準(zhǔn)：無性生活史；既往診斷有宮頸病變史；有免疫性疾病、移植、惡性腫瘤放療史；子宮已切除。

根據(jù)前期調(diào)查結(jié)果[13]，將年齡、文化程度、職業(yè)、家庭年收入、吸煙、是否絕經(jīng)做為影響宮頸HPV感染的外部因素；感染組和對(duì)照組1∶1 配對(duì)，選擇感染者和對(duì)照者各258例進(jìn)行基因多態(tài)性研究。研究對(duì)象均簽署知情同意書，研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 HPV標(biāo)本檢測(cè)和問卷調(diào)查（1）對(duì)所有篩查對(duì)象均進(jìn)行問卷調(diào)查。（2）由漯河市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科醫(yī)生用專用HPV 采樣器采集宮頸HPV 標(biāo)本，按照15種型別HPV 測(cè)試劑盒（中生方政生物技術(shù)股份有限公司）說明書，采用恒溫?cái)U(kuò)增-熒光法對(duì)15種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66和68）DNA 行半定量檢測(cè)。根據(jù)HPV檢測(cè)結(jié)果，以HPV 陽性者為感染組，陰性者為對(duì)照組。

1.2.2 血液樣本采集所有篩查對(duì)象均采集靜脈血5 mL，并用EDTA抗凝，于-80℃保存。

1.2.3 基因擴(kuò)增及測(cè)序全血DNA提取按照takara試劑盒（大連寶生物工程有限公司）操作進(jìn)行。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。PCR 擴(kuò)增體系為20 μL 體系：DNA 模板2 μL（30 ng/μL），2×PCR Taq Mix 10 μL（takrar），上下游引物各0.5 μL（10 μm/μL），ddH2O7 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95℃3 min，98℃5 s，退火30 s，退火溫度為56～63℃，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。產(chǎn)物送至通用生物（安徽）公司進(jìn)行純化，sanger 測(cè)序法測(cè)序。

表1 設(shè)計(jì)引物Tab.1 Primer Design

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，人口學(xué)特征采用卡方檢驗(yàn)，感染組及對(duì)照組各位點(diǎn)基因型的遺傳代表性采用Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)，基因多態(tài)性及單倍體分析采用Logistic回歸，單倍體的構(gòu)建采用Haploview 軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較感染組和對(duì)照組兩組間不同年齡、文化程度、職業(yè)、家庭年收入及是否吸煙、是否絕經(jīng)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 研究對(duì)象基本特征比較Tab.2 The basic characteristics of the research object

2.2 TAP/LMP/HLA-DP多態(tài)性位點(diǎn)基因型結(jié)果TAPrs1057141、LMPrs17587、HLA-DPrs3077PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為430 bp、330 bp、796 bp，電泳圖及多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果見圖1、2。

2.3 LMP/TAP/HLA-DP基因多態(tài)性分布情況經(jīng)吻合度檢驗(yàn)，TAP/LMP/HLA-DP 三位點(diǎn)的基因型分布在各組均符合Hardy Weinberg 平衡定律（感染組：P=0.421，對(duì)照組：P=0.288；感染組：P=1.002，對(duì)照組：P=0.283；感染組：P=0.064，對(duì)照組：P=0.927），各個(gè)基因型的期望值與觀察值之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所選取的樣本具有可靠性和群體代表性。

logistic回歸結(jié)果顯示HLA-DPrs3077多態(tài)純合型TT 在對(duì)照組中出現(xiàn)的頻率明顯低于感染組（P＜0.05，OR=3.667，95%CI：2.320～5.799），提示多態(tài)純合基因型TT可能增加個(gè)體宮頸高危型HPV易感性，而雜合基因型CT可能是保護(hù)性因素（P＜0.05，OR=0.306，95%CI：0.189～0.496）；LMPrs17587多態(tài)純合型TT 在對(duì)照組中出現(xiàn)的頻率明顯高于感染組（P＜0.05，OR=0.419，95%CI：0.194～0.904），提示多態(tài)純合基因型TT可能為保護(hù)因素，可能會(huì)降低個(gè)體宮頸高危型HPV易感性；TAP rs1057141 雜合基因型和多態(tài)純合基因型的頻率與各自的野生純合基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

2.4 LMP/TAP單倍型分析與HPV的易感性連鎖不平衡分析LMP rs17587、TAP rs1057141位點(diǎn)間呈連鎖不平衡關(guān)系（D′=0.772，r2=0.044），見圖3。單倍型分析發(fā)現(xiàn)：常見的單倍體型為AC，四種單倍體型在兩組間的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

圖1 LMP/TAP/HLA-DP PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Eelectrophoretogram of PCR products of locus TAPrs1057141，LMPrs17587，HLA-DPrs3077

3 討論

圖2 LMP/TAP/HLA-DP 基因位點(diǎn)測(cè)序圖Fig.2 Direct sequencing graph of locus TAPrs1057141、LMPrs17587 and HLA-DPrs3077

表3 漯河市農(nóng)村婦女LMP/TAP/HLA-DP 基因多態(tài)性分布情況Tab.3 Comparison of polymorphism distribution of locus TAPrs1057141，LMPrs17587 and HLA-DPrs3077 gene in rural women in Luohe city例（%）

宮頸是否感染HPV是內(nèi)外因共同作用的結(jié)果，與環(huán)境、生活方式、免疫、遺傳等相關(guān)[14-16]。目前關(guān)于基因多態(tài)性和HPV感染的相關(guān)性的研究較少且未排除HPV感染的外部因素[17-19]。為減少外部影響因素，使影響HPV感染和轉(zhuǎn)歸的內(nèi)因得到展現(xiàn)，作者根據(jù)前期研究[13]，從年齡、文化程度、職業(yè)、年家庭收入、吸煙、是否絕經(jīng)6個(gè)方面將感染組和對(duì)照組進(jìn)行匹配，使兩組在外因方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。河南省是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大省，漯河市尤其是農(nóng)村人口流動(dòng)性小，遺傳背景較為一致，研究對(duì)象更符合HPV感染和基因多態(tài)性的地域性特點(diǎn)。

圖3 LMP/TAP/HLA-DP 基因3個(gè)位點(diǎn)之間連鎖不平衡分析結(jié)果Tab.3 Association between locus TAPrs1057141、LMPrs17587 and HLA-DPrs3077 detected by linkage disequilibrium analysis

表4 LMP/TAP 單倍型分析與HPV的易感性關(guān)系Tab.4 Relationship between genotype of locus TAPrs1057141 and LMPrs17587 gene in cervical high-risk HPV infection group and healthy control例（%）

HPV 入侵宮頸上皮細(xì)胞以后作為抗原，主要通過抗原呈遞通路啟動(dòng)免疫應(yīng)答，引起T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別和清除，其免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱與HPV感染的預(yù)后密切相關(guān)[20]。在抗原呈遞通路中LMP 參與內(nèi)源性抗原加工，其蛋白將抗原降解為5～15個(gè)氨基酸的短肽以便與HLA 相結(jié)合[21-22]，LMP rs17587基因多態(tài)性和宮頸癌發(fā)病具有相關(guān)性[23]，但尚不清楚是否和宮頸HPV感染。作者首次對(duì)河南省漯河市農(nóng)村婦女進(jìn)行LMP rs17587基因多態(tài)性檢測(cè)，并進(jìn)行易感性關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果提示LMPrs17587多態(tài)純合型TT可能為保護(hù)因素，降低宮頸高危型HPV感染的概率（P＜0.05，OR=0.419，95%CI：0.194～0.904）。相關(guān)TAP分子參與內(nèi)源性多肽的轉(zhuǎn)運(yùn)，借助于MHC-I分子可促進(jìn)抗原呈遞通路對(duì)HPV的識(shí)別和清除[24]。MENG 等[25]研究發(fā)現(xiàn)

TAP1-rs1135216、TAP1-rs4148873、TAP2-rs2228396、TAP2-rs241447和TAP2-rs4148873 可能和腫瘤發(fā)病無關(guān)，而TAP2-rs4148876含T等位基因可能是一個(gè)癌癥發(fā)病的高危因素[25]。本研究結(jié)果TAP rs1057141雜合基因型和多態(tài)純合基因型的頻率與各自的野生純合基因型頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示其對(duì)漯河市農(nóng)村婦女宮頸是否會(huì)感染高危型HPV 無影響（P＞0.05）。HLA-II 類分子參與外源性抗原的呈遞，具有高度多態(tài)性，而特定的HLA 等位基因產(chǎn)物對(duì)所提呈的抗原有一定的選擇性[26]。HLA的基因多態(tài)性是否影響宮頸感染HPV后的抗原提呈尚不清楚，本研究選擇HLA-DPrs3077 等位基因分析研究發(fā)現(xiàn)含有T 等位基因的宮頸高危型HPV易感性是含C等位基因的2.385倍（P＜0.05，OR=2.385，95%CI：1.857～3.063），提示HLA-DPrs3077C 等位基因是HPV感染的高危因素。

因此HLA-DPrs3077和LMPrs17587基因多態(tài)性可能與河南省漯河市農(nóng)村婦女宮頸高危型HPV感染相關(guān)，而TAP rs1057141 不相關(guān)。為了進(jìn)一步的探討TAPrs1057141、LMP rs17587基因多態(tài)性和高危HPV易感性的關(guān)系，本研究構(gòu)建并分析了LMP/TAP 單倍型。研究發(fā)現(xiàn)LMP與TAP位點(diǎn)的雖存在連鎖不平衡關(guān)系但較弱（D′=0.772，r2=0.044），不同單倍體型并不會(huì)對(duì)高危HPV感染產(chǎn)生影響（P＞0.05）。可能與樣本量偏少有關(guān)有必要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步明確其易感性。

綜上所述，我們首次發(fā)現(xiàn)LMP rs17587、HLADPrs3077基因多態(tài)性與河南省漯河市農(nóng)村婦女高危HPV感染具有相關(guān)性，但TAP rs1057141 與其不相關(guān)。為進(jìn)一步研究LMP、HLA-DP與宮頸高危HPV感染和HPV 轉(zhuǎn)歸，篩查HPV感染和宮頸疾病發(fā)病高危人群提供了研究基礎(chǔ)和思路。但本研究?jī)H僅研究LMPrs17587、TAP rs1057141、HLADPrs3077基因多態(tài)性與高危型HPV感染的關(guān)系，未能進(jìn)一步細(xì)化與HPV16、18及其他HPV 高危亞型的關(guān)系，削弱了臨床指導(dǎo)價(jià)值，有必要進(jìn)一步細(xì)化研究方案。LMP與TAP位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系較弱，不同單倍體型之間不存在差異，可能LMP與TAP 對(duì)高危型HPV感染并非僅僅與LMP rs17587、HLA-DPrs3077 兩個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，有必要進(jìn)一步其他相關(guān)基因多態(tài)性位點(diǎn)，并在發(fā)生機(jī)制方面等進(jìn)行研究。