郭 健，張 力，陳力源，李玉華，楊皓杰，田一凡，朱 潔, 劉 微

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是誘發(fā)女性宮頸癌的主要原因。已知發(fā)現(xiàn)的HPV亞型達(dá)200多種，其中HPV16和18型屬于高危型中最易致癌型，超過70%的宮頸癌病變由此導(dǎo)致[1-3]。HPV疫苗是控制宮頸癌的有效手段之一。HPV的主要衣殼蛋白L1可以單獨(dú)表達(dá)并自組裝成病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)。VLPs與天然病毒的結(jié)構(gòu)高度相似，將其免疫機(jī)體后可刺激產(chǎn)生高滴度的中和抗體，目前，利用VLPs研制的HPV預(yù)防性疫苗已用于臨床。但是，此類疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答較弱。HPV基因組的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(E區(qū))編碼的E7蛋白是導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵[4-5]。E749-57表位能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTMlymphocyte，CTL)[6]。本研究中將E749-57表位嵌合進(jìn)L1后表達(dá)并組裝形成VLPs，可以同時(shí)激發(fā)較強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，可使VLPs疫苗兼具預(yù)防和治療雙重功能。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑與儀器 Balb/c小鼠購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。293FT細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保藏；BamHI、XhoI內(nèi)切酶，pET28a質(zhì)粒購自TaKaRa公司；大腸桿菌BL21(DE3)、DH5感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG購自碧云天公司；鼠抗HPV16 L1單克隆抗體購自英國Abcam公司；DMEM、1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；質(zhì)粒pShell16與pcDNA3.1-Luc+由吉林大學(xué)艾滋病疫苗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；Bright-GloTMLuciferase Assay system購自美國Promega公司；E749-57肽由上海生工公司合成；多因子流式分析試劑盒(LEGENDplexTMMouse Th1/Th2)購自美國BioLegend公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。納米粒徑電位分析儀Zetasizer Nano ZS90(Malvern, 英國)；透射電子顯微鏡H-7650(Hitachi, 日本)；AKTA蛋白純化系統(tǒng)(GE, 美國)；預(yù)裝鎳柱His Trap FF(GE-Healthcare, 美國)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad, 美國)；流式細(xì)胞儀C6(BD, 美國)。

1.2pET28a-16L1-E749-57重組質(zhì)粒的構(gòu)建 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, PDB)獲得HPV16 L1蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)作為模體，利用分子模擬軟件Discovery Studio(version 2.1)分別于BC、DE、EF和HI環(huán)形區(qū)通過同源建模分析L1最佳的E749-57表位嵌合位點(diǎn)。在預(yù)測(cè)的HPV16 L1基因序列(GenBank，序列號(hào): KU721788.1) 最佳嵌合位點(diǎn)處插入E749-57基因序列，運(yùn)用http ://www.jcat. de/對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化，獲得HPV16 L1-E749-57基因片段(上海捷瑞生物工程有限公司合成)。以合成的HPV16 L1-E749-57基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物: 5′- CGCGGATCCATGCCGTCTGAAG-CGACC-3′, 下游引物: 5′-GGCG-AGCTCTTAG-TGATGGTGATGGTGATGAAA-TTTCGGTTT-AGCTTTCAG-3′。正確的擴(kuò)增產(chǎn)物與pET28a載體雙酶切連接(BamHI和XhoI)，構(gòu)建pET28a-16L1-E749-57重組表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3HPV16L1-E749-57蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，接種于LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)。0.2 mmol/L的IPTG，16 ℃條件下誘導(dǎo)過夜。向收集的菌體沉淀中以1∶10加binding buffer，冰浴超聲15 min。分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，鑒定目的蛋白的表達(dá)及可溶性。將上清液經(jīng)鎳柱HisTrap FF親和層析，以Elution buffer(20 mmmol/L NaH2PO3, 150 mmol/L NaCl, 300 mmol/L咪唑，pH=7.4)洗脫蛋白，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純化結(jié)果。

1.4Western blot 鑒定HPV16L1-E749-57重組蛋白

HPV16L1-E749-57蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，利用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，條件為20 V、30 min。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別用HPV16 L1單克隆抗體作為一抗(1∶3 000)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG作為二抗(1∶10 000)與PVDF膜37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光顯色分析免疫印跡，檢測(cè)HPV16L1-E749-57蛋白表達(dá)是否正確。

1.5E749-57嵌合VLPs的組裝及純化 向純化的HPV16L1-E749-57蛋白中加入終濃度為10 mmol/L的DTT，4 ℃下充分作用2 h。用透析管透析72 h，待其自組裝為E749-57嵌合VLPs。于30%(w/w)蔗糖/PBS層上緩慢加入自組裝完畢的E749-57嵌合VLPs混合液，27 000 r/min 4 ℃離心3 h，取沉淀(小黃色圓斑樣物質(zhì))加1 mL PBS重懸。將重懸液緩慢沿管壁加入10 mL的29% CsCl溶液中，35 000 r/ min、4 ℃離心20 h后收集沉淀。

1.6E749-57嵌合VLPs的形態(tài)學(xué)表征

1.6.1粒徑分析 用0.22 μm 濾膜過濾嵌合VLPs樣品后，通過 Malvern Zetasizer Nano ZS90 納米粒徑電位分析儀檢測(cè)病毒樣顆粒的粒徑大小，Zetasizer Software軟件分析數(shù)據(jù)。

1.6.2電鏡觀察 將樣品滴于噴炭的銅網(wǎng)上，靜置5 min，再滴加2%磷鎢酸鉀染色，靜置5 min，自然半干固定。設(shè)定透射電鏡放大倍率為50 000倍，電壓80 kV，觀察樣品顆粒形態(tài)。

1.7E749-57嵌合VLPs的免疫原性的檢測(cè)

1.7.1假病毒的包裝與滴度檢測(cè) 將結(jié)構(gòu)基因表達(dá)質(zhì)粒pShell16與熒光蛋白報(bào)告質(zhì)粒pcDNA3.1-Luc+共轉(zhuǎn)染1×107個(gè)293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染比例為1∶4。37 ℃孵育6 h后更換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)40 h。收集細(xì)胞，加等體積裂解液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，加入NaCl溶液至終濃度0.85 mmol/L。將混合物冰浴20 min, 12 000 r/min、4 ℃離心收集上清，用0.45 μm濾器過濾后分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩⒓俨《咀?0倍稀釋，6個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度加4孔，每孔100 μL于96孔板中。將293FT細(xì)胞鋪于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)3×104個(gè)/100 μL，與假病毒稀釋液混勻。孵育72 h后，每孔取50 μL培養(yǎng)液，加等體積 Bright-GloTMLuciferase Assay試劑，作用5 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光素酶活性值，以10倍空白對(duì)照組為cutoff值，采用Reed-Muench法計(jì)算假病毒滴度(CCID50)。

1.7.2免疫血清中和試驗(yàn) 將24只Balb/c小鼠均分為3組，依次為E749-57嵌合VLPs組、野生型HPV16 VLPs組和PBS組，以Al(OH)3為佐劑。在第0、2、4周對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射免疫。在第0、1、2、3、4、6周尾靜脈采血，收集血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。?93FT細(xì)胞鋪于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)3×104個(gè)/100 μL。將待測(cè)血清做4倍倍比稀釋(初始稀釋度為1∶20)。稀釋血清和假病毒(400 CCID50/50 μL)各60 μL混合，冰浴1 h后，取混合物100 μL加入細(xì)胞板中，孵育72 h，計(jì)算假病毒滴度(方法同1.7.1)。

1.7.3Th1和Th2型細(xì)胞因子檢測(cè) 二免后3周后，分離各組小鼠脾臟。將脾臟置于200目篩網(wǎng)上并浸泡淋巴細(xì)胞分離液，注射器活塞研磨。將細(xì)胞懸液移至15 mL離心管，緩慢加入1 mL預(yù)冷的1640培養(yǎng)液，2 000 r/min離心10 min。取淡白色淋巴細(xì)胞層，2 000 r/min離心5 min收集淋巴細(xì)胞，加5 mL預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置2 min,離心收集沉淀，加預(yù)冷的1640培養(yǎng)液重懸，離心收集細(xì)胞沉淀。用PBS清洗細(xì)胞2次，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/100 μL。向細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加E749-57肽5 μg/mL，37 ℃、5% CO2條件下刺激培養(yǎng)細(xì)胞24 h。按照流式多因子分析試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1和Th2型細(xì)胞因子情況，利用BioLegend LEGENDplexTM軟件分析流式數(shù)據(jù)，得出所測(cè)細(xì)胞因子濃度值。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和分析。組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HPV16 L1最佳E749-57嵌合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過分子模擬軟件Discovery Studio(version 2.1)同源模擬后確定HPV16 L1的HI loop區(qū)355/356為最佳表位嵌合位點(diǎn)(圖1)。

A: The virtual structure of E749-57 chimeric L1 monomer； B: The virtual structure of E749-57 chimeric L1 pentamer圖1 最佳嵌合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of the optimal chimeric site

2.2pET28a-16L1-E749-57重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pET28a-16L1-E749-57重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，得到目的基因條帶為1 400 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。將質(zhì)粒進(jìn)行核酸測(cè)序，結(jié)果顯示序列正確。

M: DNA Marker; 1: pET28a-16L1-E749-57 plasmid; 2: PCR product圖2 pET28a-16L1-E749-57重組質(zhì)粒PCR鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a-16L1-E749-57 by PCR

2.3HPV16L1-E749-57蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)HPV16L1-E749-57蛋白。將誘導(dǎo)菌體的上清和沉淀分別用SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果如圖3，誘導(dǎo)后在55 kD處可見特異性條帶，表明蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。檢測(cè)誘導(dǎo)后超聲破碎菌體后的上清與沉淀中均含有目的蛋白，且在上清中濃度較高，初步判斷目的蛋白為可溶性蛋白(圖4)。

M: Protein marker; 1: Before induction; 2: After induction圖3 HPV16L1-E749-57蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of HPV16L1-E749-57 protein

M: Protein marker; 1 and 3: Precipitation of broken bacteria; 2 and 4: Supernatant of broken bacteria圖4 HPV16L1-E749-57蛋白可溶性鑒定Fig.4 Identification about solubility of HPV16L1-E749-57 protein

2.4HPV16L1-E749-57蛋白的純化 收集重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后的上清液，經(jīng)鎳柱His Trap FF親和層析，收集洗脫流分。SDS-PAGE電泳(圖5)，結(jié)果顯示經(jīng)鎳柱純化后得到較高純度目的蛋白。蛋白免疫印跡(Western blot)(圖6)顯示在55 kD處出現(xiàn)目的斑帶，證明目的蛋白表達(dá)正確。

M: Protein marker; 1, 2, 3: 1 to 3 eluted fraction with 300 mmol/L imidazole圖5 HPV16L1-E749-57蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of HPV16L1-E749-57 protein

M: Protein marker; 1, 2, 3: HPV16L1-E749-57 protein圖6 HPV16L1-E749-57蛋白純化的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of HPV16L1-E749-57 protein

2.5E749-57嵌合VLPs的形態(tài)學(xué)表征 將體外組裝后的E749-57嵌合VLPs進(jìn)行動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析和透射電鏡檢測(cè)，可觀察到大量形態(tài)結(jié)構(gòu)、直徑(50～55 nm)與野生VLPs基本一致的球形顆粒，且粒徑均一(圖7，圖8)，說明HPV16L1-E749-57蛋白在體外成功自組裝為VLPs。

2.6E749-57嵌合VLPs的免疫原性檢測(cè)

圖7 E749-57嵌合VLPs粒徑分析Fig.7 Size distributions of cVLPs-E749-57

2.6.1假病毒滴度及中和試驗(yàn) 采用Reed-Muench法計(jì)算CCID50來表示假病毒滴度。結(jié)果顯示假病毒的滴度為105.9/100 μL。

以400 CCID50/50 μL假病毒接種量測(cè)陽性血清中和滴度。初次免疫后E749-57嵌合VLPs組小鼠血清中和抗體滴度log10平均值為2.63；隨著第2、3次免疫，中和抗體滴度明顯升高，第6周時(shí)log10平均值達(dá)到4.23。野生型HPV16 VLPs組小鼠在初次免疫后血清中和抗體滴度log10平均值為3.17, 加強(qiáng)免疫后，第6周時(shí)log10平均值達(dá)到4.45。E749-57嵌合VLPs組中和抗體滴度較野生型HPV16 VLPs組略低(χ2=7.575，P<0.05)(圖9)。

圖9 免疫血清中和試驗(yàn)Fig.9 Neutralization test of serum samples

2.6.2Th1和Th2型細(xì)胞因子檢測(cè) 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)E749-57肽體外刺激后，用流式多因子法檢測(cè)Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況。結(jié)果如圖10所示，E749-57嵌合VLPs能刺激小鼠分泌高水平的 Th1型細(xì)胞因子(INF-γ, IL-2, TNF-α), 與野生型HPV16 VLPs相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.410、4.333、8.308，P均<0.05)，提示E749-57嵌合VLPs能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí)，E749-57嵌合VLPs刺激小鼠分泌的Th2型細(xì)胞因子水平與野生型HPV16 VLPs組相似(IL-5, IL-10)，而野生型HPV16 VLPs組刺激小鼠分泌的IL- 4的含量更高一些。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001圖10 Th1和Th2型細(xì)胞因子水平檢測(cè)Fig.10 Levels of Th1 and Th2 cytokines

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性惡性腫瘤第2位,且發(fā)病逐漸趨于年輕化[7-9]。據(jù)世衛(wèi)組織報(bào)道，2018年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例57萬，死亡人數(shù)31.1萬[10], 嚴(yán)重危害女性健康。目前宮頸癌預(yù)防性疫苗的研究較成功，國際上市的HPV疫苗分別是默沙東公司生產(chǎn)的四價(jià)疫苗佳達(dá)修-4 (Gardasil-4)和九價(jià)疫苗佳達(dá)修-9(Gardasil-9)，及葛蘭素史克公司的二價(jià)疫苗希瑞適(Cervarix)，3種疫苗均是以體外表達(dá)的HPV L1衣殼蛋白自組裝成VLPs為有效抗原，混合佐劑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。此類疫苗能有效預(yù)防高危型HPV病毒感染，但對(duì)已經(jīng)感染HPV的人群無效[11-12]。

為了使疫苗具有治療功能，HPV E7基因成為近年來國際上的研究熱點(diǎn)[13-14]。E7蛋白作為高危型(HPV16、18、31、45)早期致癌蛋白，能干擾宿主細(xì)胞正常周期，誘導(dǎo)細(xì)胞無限增殖最終進(jìn)展為癌癥[15-16]。E7蛋白在宮頸癌及癌前病變組織中持續(xù)表達(dá)，是腫瘤特異性抗原，因此成為免疫治療的理想靶標(biāo)[17-18]。但全長(zhǎng)E7蛋白仍有轉(zhuǎn)化活性，不能直接應(yīng)用到疫苗中[19]，而將優(yōu)勢(shì)表位E749-57(短肽)作為抗原遞送至患者體內(nèi)，既能保證疫苗安全，又能有效激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，特異性殺傷表達(dá)E7蛋白的腫瘤細(xì)胞，起到免疫治療作用[20]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)此已展開研究: Liu WJ等[21]利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)牛乳頭瘤病毒1型(bovine papillomavirus type 1, BPV1)L1嵌合E749-57蛋白(插入多個(gè)表位取代L1的C末端23個(gè)氨基酸); Monroy-García A等[22]利用番茄表達(dá)HPV16 L1嵌合E749-57蛋白(插入多個(gè)表位取代L1的C末端34個(gè)氨基酸)，形成的嵌合VLPs均可刺激小鼠產(chǎn)生E749-57表位特異性CTL。褚曉杰[23]將E749-57表位與乙肝核核心抗原(HBcAg)嵌合，制備的HBcAg -VLPs能夠激發(fā)持續(xù)有效的特異細(xì)胞免疫應(yīng)答并顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些研究共同揭示了E749-57表位嵌合型VLPs成為治療性疫苗載體的潛力。

在本研究中，通過同源模擬分析HPV16 L1 環(huán)形區(qū)最佳嵌合位點(diǎn)。該方法利用生物信息學(xué)的手段，可以直接從蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。所有的建模方法中，以同源建模法應(yīng)用最為廣泛，預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性最大[24-25]。我們以已知的天然HPV VLPs的結(jié)構(gòu)為模體，預(yù)測(cè)表位嵌入后順利組裝成VLPs的可能結(jié)構(gòu)，最終確定HI loop區(qū)355/356為最佳嵌入點(diǎn)。將優(yōu)勢(shì)CTL表位E749-57嵌入該位點(diǎn)，形成的VLPs粒徑均一，形態(tài)飽滿，穩(wěn)定性好，與野生型VLPs相似度高，這樣的結(jié)構(gòu)對(duì)激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答極為重要。構(gòu)建HPV16 L1- E749-57基因突變體后利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，成本低廉，VLPs得率較高，這為疫苗的生產(chǎn)提供更大的可能性。

嵌合型VLPs免疫小鼠后，能激發(fā)小鼠體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生中和抗體，但是與野生組比較中和抗體滴度偏低；對(duì)細(xì)胞因子水平檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)嵌合組的IL-4(Th2型)細(xì)胞因子水平也略低于野生組。此前報(bào)道顯示，HPV主要中和抗體HPV16.V5的中和表位位于HPV16 L1的FG 和HI loop區(qū)，將表位插入HI loop區(qū)(352/353)致使嵌合后的VLPs免疫原性與野生型相比下降[26]。我們推測(cè)，在L1- E749-57嵌合過程中(插入位點(diǎn)355/356)一定程度上破壞了L1原有的中和表位的完整性，影響到體液免疫應(yīng)答發(fā)生。但是嵌合型VLPs可以刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，使VLPs能夠具備預(yù)防和治療雙重功效，這與我們的初衷是一致的。

人乳頭瘤病毒16型表位嵌合病毒樣顆粒(E749-57嵌合VLPs)的構(gòu)建為宮頸癌治療性疫苗的探索和研制提供重要基礎(chǔ)，對(duì)于控制和治療宮頸癌、保障女性健康有著重要意義。

利益沖突：無