郭海勇，趙 雪，朱小雨，趙研彤，林依丹，施 爽，李 鑠，計銀鐸，宋勤葉

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起人及動物感染的重要致病菌之一，隨著抗生素的廣泛大量應(yīng)用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，且具有持續(xù)進化的抗藥性機制，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantS.aureus，MRSA)的傳播已超出醫(yī)院感染的傳播范圍，成為社區(qū)獲得性(community-acquired methicillin-resistantS.aureus，CA-MRSA)和家畜獲得性(livestock-associated MRSA，LA-MRSA)病原菌，通常引起皮膚和軟組織感染，也能引起嚴重的侵襲性疾病，如壞死性肺炎、膿毒血癥、心內(nèi)膜炎等[1]。MRSA還能引起奶牛、羊的乳腺炎及豬、禽、兔等其他動物的葡萄球菌病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失[2]。

凝固酶(coagulase，Coa)和血管性血友病因子結(jié)合蛋白(von Willebrand factor binding protein，vWbp)是金黃色葡萄球菌分泌的兩種促進凝血的蛋白，能非酶解性地激活凝血酶原，在宿主感染過程中起到關(guān)鍵作用[3-4]。Coa是一種含有670個氨基酸左右的蛋白質(zhì)，且在不同的菌株中長度不同[5]，由N-末端部分的D1-D2結(jié)構(gòu)域和C-末端部分的27個殘基片段的R結(jié)構(gòu)域串聯(lián)重復組成。宿主凝血酶原的激活是通過Coa的N端高度可變的D1-D2結(jié)構(gòu)域介導的，C端保守的R結(jié)構(gòu)域通過將纖維蛋白原引導到金黃色葡萄球菌表面，產(chǎn)生抑制吞噬作用的纖維蛋白保護膜，從而高效地逃避固有免疫系統(tǒng)的識別和消除[6-7]，同時也能應(yīng)對抗生素的殺傷作用[8]，引起嚴重的感染性疾病。

金黃色葡萄球菌感染和食物中毒事件已成為世界性的公共衛(wèi)生問題，尋找對侵襲性金黃色葡萄球菌感染的保護性免疫一直是研究的主要目標，但目前還沒有較理想的金黃色葡萄球菌疫苗成功[9]。研究顯示，金黃色葡萄球菌凝固酶失活或被中和可預防葡萄球菌感染，說明以凝固酶制備的疫苗或凝固酶抑制劑可以作為治療金黃色葡萄球菌感染的一種替代策略[3,10-11]。本研究首先構(gòu)建了表達金黃色葡萄球菌USA300 CA-MRSA 923 的原核表達質(zhì)粒pET-24b-coa，在IPTG誘導下體外表達了Coa重組蛋白，通過血漿凝固酶試驗和動物試驗，檢測了表達的重組Coa(rCoa)的生物活性，旨在為研究開發(fā)以金黃色葡萄球菌Coa作為靶點的金黃色葡萄球菌疫苗和抗該菌感染的抑制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株和載體 金黃色葡萄球菌 923(USA300 CA-MRSA)、E.coliDH10B 菌株由美國明尼蘇達大學計銀鐸教授饋贈，E.coliBL21(DE3)菌株為吉林師范大學微生物研究室保存。pET-24b(+)表達載體為Novagen公司產(chǎn)品。

1.2主要試劑 Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒、Prestained Protein Marker Ⅲ購自天根生化科技(北京)有限公司；膠回收、質(zhì)粒小提試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自biosharp生物科技公司；1 kb DNA Ladder、 Color Prestained Protein Standard購自NEB(北京)公司；硝酸纖維素膜為Pharmacia公司產(chǎn)品。兔抗His-tag抗體、HRP標記羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG均購自北京索萊寶科技有限公司。金黃色葡萄球菌重組蛋白rSarZ，由本實驗室制備并保存。

1.3實驗動物 7周齡BALB/c雌性小鼠購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)于溫度為25 ℃的潔凈動物室，12 h光照，自由采食和飲水。購入小鼠飼養(yǎng)7 d后開始進行動物實試驗。

1.4引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank報道的金黃色葡萄球菌coa基因序列(Accession No. AB488504)以及表達載體pET-24b(+)酶切位點設(shè)計特異性引物，F(xiàn)1：5′-TTTGGATCCATGAAAAAGCAAATAATTTC-3′，下劃線序列為BamHⅠ酶切位點；R1： 5′-CCGCTCGAGTTTTGTTACTCTAGGCCCAT-3′，下劃線序列為XhoI酶切位點，目的片段長度為1 989 bp。測序通用引物T7 promoter F：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，T7 Terminator R：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.5coa基因的PCR擴增 利用細菌基因組提取試劑盒提取金黃色葡萄球菌 923(USA300 CA-MRSA)基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系為50 μL：10× Ex Taq buffer 5 μL，dNTP mix 5 μL，2.5 mmol/L Mg2+5 μL，上、下游引物各1 μL(0.2 μmol/L)，Ex Taq DNA聚合酶0.25 μL(1.25U)，DNA模板2 μL，無菌水補至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min后終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切。同時用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切pET-24b(+)表達載體，純化回收并在T4 DNA連接酶的作用下與coa基因連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-24b-coa。將5 μL重組質(zhì)粒pET-24b-coa加入到50 μLE.coliDC10B感受態(tài)細胞中混勻，冰上放置20 min；將質(zhì)粒與感受態(tài)細胞混合物轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯中，立即用電穿孔儀轉(zhuǎn)化(BIO-RAD MicroPulser)，輸出電壓為1 800 V，脈沖持續(xù)時間為5 ms。電轉(zhuǎn)后感受態(tài)細胞經(jīng)卡那霉素(50 μg/mL)抗性篩選，挑取陽性菌落提取重組表達質(zhì)粒pET-24b-coa，經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切及PCR鑒定后，將質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.7重組蛋白的誘導表達 將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)，涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑轉(zhuǎn)化后的單菌落接種于含卡那霉素(30 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 培養(yǎng)過夜，然后按照1∶100接種到含卡那霉素和氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 培養(yǎng)至OD600達到0.6 時加入終濃度為1 mmol/L的IPT G誘導，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)，于誘導0、1、2、3、4、6 h 分別取樣1 mL制備蛋白上樣，進行12% SDS-PAGE分析確定最佳誘導時間，以培養(yǎng)過夜的空載體 pET-24b(+)作為陰性對照。

1.8重組蛋白表達形式分析與純化 在確定最佳誘導條件后，菌液培養(yǎng)至OD600=0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30 ℃，200 r/min振搖誘導培養(yǎng)4 h，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min收集菌體，每100 mg菌體加入2 mL細菌裂解液重懸，冰浴超聲破碎(功率45 %，工作10 s，間隔10 s)直至清亮不粘稠，4℃ 10 000 r/min離心20 min，分離上清和沉淀。分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析重組蛋白的表達形式。按照說明，用Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白和BCA蛋白濃度測定試劑盒測定目的蛋白含量，分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9Western blot 檢測 將純化的重組蛋白rCoa進行SDS-PAGE分析，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至NC膜上，以封閉液(TBST+5%脫脂乳)4 ℃ 封閉過夜，與兔抗His-tag抗體(1∶1 000)室溫反應(yīng)2 h；洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室溫反應(yīng)2 h，洗膜后，以DAB顯色試劑盒避光顯色5 min，蒸餾水終止顯色，觀察結(jié)果、拍照。

1.10重組蛋白凝固活性檢測 按照醫(yī)學實驗標準抽取健康成人的靜脈血液，新鮮的人血液收集在肝素抗凝管中，立即進行血液凝固試驗。將0.1 μg的純化重組蛋白rCoa分別加入500 μL的新鮮血液和500 μL兔血漿中，37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h觀察結(jié)果。同時設(shè)立不加重組蛋白rCoa的血液和兔血漿為空白對照以及分別加入空載體pET-24b(+)/BL21誘導表達蛋白和金黃色葡萄球菌重組蛋白rSarZ的兔血漿為陰性對照。

1.11重組蛋白的免疫原性分析

1.11.1小鼠免疫 選取8周齡BALB/c小鼠6只，隨機分成2 組，即免疫組和對照組，每組3只。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的rCoa，第2次和第3次免疫用弗氏不完全佐劑乳化的rCoa。每次免疫間隔2周，每次每只小鼠經(jīng)背部皮下多點接種50 μg rCoa。對照小鼠接種等量體積弗氏完全佐劑或不完全佐劑乳化的PBS。最后1次免疫后10 d采血分離血清，分裝后-20 ℃凍存。

1.11.2血清抗體水平的間接ELISA測定 以濃度為1 μg /mL的純化重組蛋白rCoa包被酶標板，4 ℃過夜；PBST洗滌4次，每次3 min，用5 %犢牛血清37 ℃封閉2 h；PBST洗滌，將重組蛋白rCoa三免10 d后獲得的3只小鼠抗血清分別用5 %犢牛血清進行倍比稀釋，分別加入對應(yīng)蛋白孔，37℃孵育1 h，同時設(shè)陰性對照；PBST洗滌，加入用5%犢牛血清稀釋(1∶1 000)的HRP標記羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，每孔加入50 μL TMB顯色液，避光顯色20 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，檢測OD450值。

1.11.3重組蛋白rCoa免疫原性的Western blot分析 將純化的重組蛋白rCoa進行SDS-PAGE分析，轉(zhuǎn)膜、封閉后，與鼠抗Coa陽性血清(1∶100)室溫反應(yīng)2 h，充分洗膜后，加入HRP標記的羊抗鼠 IgG 二抗(1∶2 000)，室溫反應(yīng)2 h，DAB顯色，觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒pET-24b-coa的構(gòu)建與鑒定 金黃色葡萄球菌coa基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1 500～2 000 bp之間可見單一擴增條帶(圖1)，大小與預期1 989 bp相符。將經(jīng)BamHI、XhoⅠ雙酶切的PCR產(chǎn)物插入pET-24b(+)載體構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。利用BamHI、XhoI雙酶切及PCR對重組表達質(zhì)粒鑒定，得到的條帶與預期目的基因片段的大小相符(圖2)，表明coa基因已成功克隆至pET-24b(+)載體，且測序所得序列與S.aureus923株的coa基因序列一致，重組質(zhì)粒pET-24b-coa構(gòu)建成功。

M：1kb DNA分子量標準；1：coa基因擴增產(chǎn)物圖1 coa基因的PCR擴增Fig.1 Amplification of coa gene by PCR in S.aureus 923

M：1kb DNA分子量標準；1：coa基因擴增產(chǎn)物；2：重組質(zhì)粒pET-24b-coa；3：pET-24b-coa的BamHⅠand XhoⅠ酶切產(chǎn)物圖2 coa基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒pET-24b-coa的酶切鑒定Fig.2 PCR amplification of coa gene and digestion identification of pET-24b-coa

2.2重組蛋白的誘導表達 表達菌E.coliBL21(DE3)經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導1、2、3、4、6 h 進行SDS-PAGE分析，在誘導1 h時，rCoa蛋白開始表達，在相對分子質(zhì)量約為74.8 ku 處有明顯的蛋白質(zhì)表達條帶，與目的蛋白基本一致，但表達量較低。當誘導4 h和6 h時rCoa蛋白表達量差不多，達到最高，因此在蛋白表達時選擇誘導時間為4 h。陰性對照含空載體pET-24b(+)的工程菌和未誘導對照菌中未見有目的蛋白表達(圖3)。

M：蛋白質(zhì)分子量標準(NEB)；1：誘導4 h后pET-24b-coa/BL21菌體超聲裂解后上清；2：誘導4 h后pET-24b/ BL21菌體沉淀；3：未誘導的pET-24b-coa/BL21菌體沉淀；4～8：分別為誘導1 h、2 h、3 h、4 h和6 h后pET-24b-coa/BL21菌體沉淀圖3 不同誘導時間重組蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the expression of rCoa by different induced time

2.3重組蛋白的表達形式 IPTG誘導表達4 h的菌液離心收集菌體，超聲破碎后分離的沉淀和上清經(jīng)SDS-PAGE分析，在沉淀中出現(xiàn)74.8 ku的目的蛋白條帶，而在上清中未發(fā)現(xiàn)目的蛋白條帶，表明rCoa以包涵體的形式表達(圖4A)。目的蛋白經(jīng)Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化的SDS-PAGE結(jié)果見圖4B，純化蛋白經(jīng)定量后，濃度為1.02 μg/μL。

A：誘導后菌體超聲裂解上清和沉淀的SDS-PAGE分析；B：純化rCoa的SDS-PAGE分析；M：蛋白質(zhì)分子量標準；1：重組菌超聲裂解液沉淀；2：重組菌超聲裂解液上清；3：純化rCoa圖4 重組蛋白rCoa的表達形式分析結(jié)果Fig.4 Analysis of the recombinant protein rCoa expression patterns

2.4重組蛋白的Western Blot分析 將純化后的rCoa蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，一抗為兔抗His-tag抗體(1∶1 000)，二抗為HRP-羊抗兔IgG(1∶2 000)，經(jīng)Western Blot分析顯示在74.8 ku處出現(xiàn)一條很清晰的特異性反應(yīng)條帶(圖5)，表明純化獲得目的蛋白質(zhì)能被抗His單克隆抗體特異性識別。

M：預染蛋白質(zhì)Marker Ⅲ；1：pET-24b/BL21陰性對照 2：重組蛋白rCoa圖5 重組蛋白的Western-blot 分析Fig.5 Western-blot analysis of recombinant protein rCoa

2.5重組純化蛋白的凝固活性 當純化的rCoa與新鮮人抗凝血或兔血漿在37 ℃恒溫中共同孵育6 h后，重組蛋白rCoa能使人全血和兔血漿完全凝固，當傾斜試管時血液和兔血漿不流動。而未加rCoa的空白對照沒有凝固現(xiàn)象出現(xiàn)，傾斜時血液及兔血漿沿管壁流動，含空載體pET-24b(+)大腸桿菌表達蛋白和金黃色葡萄球菌重組蛋白rSarZ的陰性對照組均不能使兔血漿凝固(圖6)，結(jié)果表明表達的rCoa具有良好的凝固人血液或兔血漿活性。

A：重組蛋白的凝血活性；B：重組蛋白凝固兔血漿活性；1：重組蛋白rCoa；2：未加重組蛋白rCoa空白對照；3：含空載體pET-24b/BL21陰性對照；4：金黃色葡萄球菌重組蛋白rSarZ陰性對照圖6 重組蛋白對人血液和兔血漿的凝固活性Fig.6 Coagulation activity of the rCoa in human whole blood and rabbit plasma

2.6重組蛋白的免疫原性 第3次用rCoa免疫后10 d收集免疫組和對照組小鼠血清，將免疫組3只小鼠的血清分別進行倍比稀釋，同時對照組3只小鼠血清混合做倍比稀釋，以濃度為1 μg/mL的rCoa包被酶標板進行間接ELISA檢測，結(jié)果顯示在3只免疫小鼠的血清中都檢測到了高效價的特異性抗體，抗體水平均在1∶6 400以上，而對照小鼠的血清中未檢測到相應(yīng)抗體(OD450<0.18)(圖7)。該結(jié)果表明rCoa能刺激小鼠產(chǎn)生高效價的抗Coa特異性抗體，且具有良好的免疫原性。

圖7 重組蛋白rCoa抗血清的間接ELISA檢測Fig.7 Determination of indirect ELISA assay for recombinant protein rCoa antibody

Western blot檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠血清能夠與轉(zhuǎn)移到NC膜上的rCoa特異性結(jié)合，在74.8 ku處出現(xiàn)一條很清晰的特異性反應(yīng)條帶，表明rCoa能被小鼠抗Coa陽性血清所識別，具有良好的抗原結(jié)合活性(圖8)。

M:預染蛋白質(zhì)Marker Ⅲ； 1：pET-24b/BL21陰性對照 2：重組蛋白rCoa圖8 重組蛋白免疫原性的 Western blot分析Fig.8 Western blot analysis of immunogenicity of rCoa

3 討 論

金黃色葡萄球菌是引起人獸共患病重要的病原細菌之一，其強致病性依賴于多種毒素和侵襲性酶等毒力因子的產(chǎn)生，凝固酶是金黃色葡萄球菌SaeRS系統(tǒng)直接調(diào)控的重要毒力因子[12-13]，凝固酶將宿主凝血酶原轉(zhuǎn)化為葡萄球菌凝血酶，從而將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，引起局部凝塊保護細菌免受吞噬和免疫防御，介導Coa依賴型生物膜的形成，增強細菌耐藥性[14-15]。凝固酶是金黃色葡萄球菌的表型決定簇，是鑒定金黃色葡萄球菌和區(qū)分凝固酶陽性和陰性葡萄球菌的重要因素[15]。Trivedi等[16]認為凝固酶的分泌是金黃色葡萄球菌在感染過程中適應(yīng)的一個決定性特征。

金黃色葡萄球菌凝固酶Coa在皮膚膿腫、導管相關(guān)感染、心內(nèi)膜炎和乳腺炎等疾病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，預示著Coa是預防或治療金黃色葡萄球菌感染的重要靶點[17-18]。此外，針對葡萄球菌凝血酶活性的抑制劑可作為抗生素治療的輔助手段[19]。Cheng等[3]研究表明針對Coa的特異性抗體對膿腫形成和致死性菌血癥具有保護作用，提示凝固酶可作為葡萄球菌疫苗的保護性抗原誘導產(chǎn)生抗體，保護宿主免受金黃色葡萄球菌感染。Thomer等[20]研究表明針對Coa的R結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體降低了人血液中的細菌載量，證實Coa的保守R結(jié)構(gòu)域可作為抗MRSA感染疫苗的新靶標。Qian等[21]構(gòu)建了一個新的R結(jié)構(gòu)域CoaR6，通過將CoaR6與破傷風神經(jīng)毒素重鏈的C端片段Hc融合，提高 R 結(jié)構(gòu)域免疫原性，融合蛋白 Hc-CoaR6成功地提高了免疫小鼠的抗 CoaR6 IgG 水平，為Coa的R結(jié)構(gòu)域成為金黃色葡萄球菌候選疫苗靶標提供了強有力的科學依據(jù)。WANG 等[22]應(yīng)用可以抑制Coa活性但不影響金黃色葡萄球菌活力的槲皮素治療導管感染的大鼠，結(jié)果顯示，通過槲皮素的治療可以減少導管表面的細菌滯留，降低大鼠腎臟中的細菌負荷，并減輕了體內(nèi)膿腫，表明以 Coa為靶點的天然化合物抗金黃色葡萄球菌感染是一種新策略，同時靶向Coa可降低產(chǎn)生耐藥性的可能性。

pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強系統(tǒng)，本研究采用的pET-24b(+)表達載體能在大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中調(diào)節(jié)基礎(chǔ)表達水平以優(yōu)化coa基因的高效表達，通過優(yōu)化表達條件獲得了高表達量的重組蛋白rCoa，表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在，這可能是在表達過程中目的蛋白形成了錯配二硫鍵。包涵體經(jīng)Ni-Agarose His 標簽試劑盒純化后不影響凝血活性和多克隆抗體的制備。純化獲得的重組蛋白rCoa對含抗凝劑的人全血和兔血漿有較好的凝集作用，這與張葉影等[23]研究報道相一致。用純化的rCoa免疫小鼠，通過間接ELISA方法檢測到3只免疫小鼠的血清抗體水平均在1∶6 400以上，結(jié)果說明表達的rCoa能夠充分刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體，具有良好的免疫原性，下一步研究將側(cè)重于探討Coa蛋白對金黃色葡萄球菌感染的免疫保護效果及其在感染中的確切作用。此外本試驗中建立的間接ELISA方法還可用于金黃色葡萄球菌凝固酶血清抗體水平的檢測，可為金黃色葡萄球菌感染的血清學診斷和監(jiān)測提供技術(shù)支持。

本試驗以USA300 CA-MRSA 923 菌株基因組DNA為模板成功擴增出coa基因，將coa基因與pET-24b(+)表達載體連接，構(gòu)建了重組pET-24b-coa/BL21的原核表達體系，獲得了重組蛋白rCoa。rCoa具有良好的凝固酶活性和抗原活性，為進一步研究開發(fā)以Coa為靶點的抗金黃色葡萄球菌感染的抑制劑和疫苗奠定了重要基礎(chǔ)。

利益沖突：無