師浩桐，張淑婷，樊衛(wèi)萍，李軍鋒，姚 紅

近年來高致病性冠狀病毒多次暴發(fā)流行侵?jǐn)_人類，從2003年中國暴發(fā)的SARS-CoV，到2012年的中東地區(qū)流行的中東呼吸綜合癥冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)[1]再到2019年年底的新型冠狀病毒(2019-nCoV)。這些病毒的暴發(fā)流行引發(fā)了人類對該類病毒深入研究的熱潮。其中MERS-CoV是2012年6月首次在沙特阿拉伯地區(qū)發(fā)現(xiàn)的目前為止的致病率最高、致死率最高的冠狀病毒[2]，蝙蝠可能為其第一宿主[3]，駱駝被證明是其中間宿主，已經(jīng)證明該病毒可以在駱駝之間相互傳播，而后發(fā)生了從駱駝到人之間的傳播[4]。該病毒感染人后除少數(shù)患者以胃腸道癥狀為首發(fā)體征的病例外，主要引起的呼吸道癥狀，后續(xù)可能會發(fā)生呼吸窘迫，缺氧發(fā)生進(jìn)而導(dǎo)致呼吸衰竭[5]。

截止到2019年11月，全球有2 494人感染了MERS-CoV，這些患者分布在全球27個國家，包括沙特阿拉伯、韓國、伊朗、約旦、卡塔爾、英國、美國、中國和泰國，其中有858人死亡(病死率：34.4%)，其中大部分病例來自于阿拉伯地區(qū)。這種病毒較其他冠狀致病性更強(qiáng)，致死率更高。MERS-CoV感染宿主致病機(jī)制依然不清楚，對其致病機(jī)制的研究將有利于制定更為有效的防控策略，以及開發(fā)出更高效的治療和防護(hù)手段。

病毒是依賴于宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和傳播的一類微生物。病毒感染宿主細(xì)胞，與宿主之間存在復(fù)雜的相互作用。通過影響宿主基因表達(dá)是病毒維護(hù)自身生存和復(fù)制的重要策略，也是病毒影響宿主細(xì)胞功能引起疾病的重要原因。MERS-CoV是基因組為長度約27～32 kb的單鏈正義RNA病毒，病毒蛋白組較為復(fù)雜。與其他RNA病毒比較，與該病毒相關(guān)受到病毒調(diào)控的宿主因子雖有一些報道，但認(rèn)識仍處于早期階段[6]。目前還沒有針對MERS-CoV感染引起宿主細(xì)胞特別是呼吸細(xì)胞基因表達(dá)改變的系統(tǒng)全面分析的文獻(xiàn)報道。MERS-CoV主要通過感染呼吸道的細(xì)胞，引起呼吸系統(tǒng)及全身疾病。為了更全面的理解MERS-CoV與呼吸道上皮的相互作用，全面分析參與保護(hù)病毒、促進(jìn)病毒復(fù)制和致宿主疾病的宿主因子。我們擬選擇MERS-CoV感染呼吸道上皮基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對病毒引起的宿主表達(dá)差異基因進(jìn)行篩選，分析這些基因功能，細(xì)胞分布，參與的生物過程及參與的細(xì)胞信號通路。分析這些異常的信號通路是否參與病毒致病，為確定病毒致病的分子機(jī)理提供幫助。我們還將從差異表達(dá)分子中篩選致病關(guān)鍵分子，為尋找新的治療靶標(biāo)，探索新的治療策略提供數(shù)據(jù)。

1 研究方法

1.1數(shù)據(jù)集的獲取和分析 在美國國立生物中心(US National Center for Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站GEO(gene expression omnibus )數(shù)據(jù)庫中搜索MERS-CoV感染的肺相關(guān)細(xì)胞的芯片數(shù)據(jù)。檢索關(guān)鍵詞MERS-CoV 查詢到ID號為200100504，芯片數(shù)據(jù)編碼為：GSE100504。該芯片為MERS-CoV標(biāo)準(zhǔn)株EMC2012病毒感染的人氣道上皮細(xì)胞，以每個細(xì)胞5 個PFU病毒量感染病毒，包括50個樣品，分為對照細(xì)胞組和感染細(xì)胞組，兩組收集的時間點(diǎn)為感染后0、12、24、36和48 h計5個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)有5個平行感染重復(fù)。

1.2差異表達(dá)分析 使用基于Bioconductor項(xiàng)目中的GEOquery和limma R包的在線分析工具GEOR分析各個時間點(diǎn)的對照組和實(shí)驗(yàn)組的各個基因的表達(dá)情況，以典型的差異最明顯的48 h的時間點(diǎn)作為差異分析的數(shù)據(jù)。篩選差異P<0.05，表達(dá)值增加或降低兩倍以上的基因作為差異基因，差異基因的表達(dá)分布展示則依據(jù)其表達(dá)增加或降低倍數(shù)及P值，使用R語言的ggplots2包制作火山圖。

1.3差異基因的功能富集 以上述篩選到的差異明顯表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的基因作為研究對象，使用生物信息數(shù)據(jù)庫DAVID(the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)對篩選出基因的分子功能(Molecular Function, MF)、參與的生物過程(biological process, BP)和細(xì)胞組成(cellular component, CC)，以及在細(xì)胞中參與的KEGG(京都基因與基因組百科全書 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號通路。

1.4差異基因相互作用分析及關(guān)鍵基因篩選 以上述差異基因?yàn)榉治鰧ο? 使用String 網(wǎng)站在線分析基因之間的相互作用，構(gòu)建相互作用的網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置最小相互作用分?jǐn)?shù)為highest confindence 0.900，對得到的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)引入cytoscape中Network，使用cytoscape軟件中的cytohubba插件計算，選擇degree拓?fù)浞治龇ㄇ?0個基因，作為基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的節(jié)點(diǎn)基因。

2 結(jié) 果

2.1MERS-CoV感染的對支氣管上皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響 使用GEOR在線分析GEO數(shù)據(jù)庫GSE100504表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。研究MERS-CoV感染的支氣管上皮原代細(xì)胞，在不同時間點(diǎn)未感染組和感染組之間的基因表達(dá)差異。選擇差異最為明顯的感染48 h作為研究對象進(jìn)行差異倍數(shù)分析。選擇P<0.05，且基因表達(dá)差異大于兩倍的基因作為差異表達(dá)基因。結(jié)果篩選到了差異表達(dá)基因1 553個基因，其中表達(dá)增加850個，表達(dá)降低703個，各個基因表達(dá)差異及P值分布使用R語言的 ggplot2包分析得到火山圖(圖1)，其中綠色點(diǎn)為差異明顯的基因分布點(diǎn)。

Volcano Plot indicated up-regulated and down-regulated mRNAs. The abscissa represents log2FC and the ordinate represents log10(adjusted P-value). The green plots represent different expression genes圖1 MERS-CoV感染的對支氣管上皮細(xì)胞基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of MERS-CoV infection on gene expression of bronchial epithelial cells

2.2差異基因的基因功能分析 通過研究病毒感染細(xì)胞差異基因的功能，可以發(fā)現(xiàn)參與疾病的基因。為了研究MERS-CoV病毒引起的細(xì)胞基因改變是否參與病毒的致病，首先研究這些基因在細(xì)胞中的功能，對上述MERS-CoV感染引起支氣管上皮細(xì)胞基因表達(dá)差異明顯的基因進(jìn)行GO功能注釋。分別以表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)檠芯繉ο螅治霾町惐磉_(dá)基因的功能、細(xì)胞組成及參與的生物過程。結(jié)果顯示：表達(dá)上調(diào)分子廣泛分布于支氣管上皮細(xì)胞的胞質(zhì)、角質(zhì)化包膜、細(xì)胞外空間、核小體、線粒體外膜、MHCI類蛋白質(zhì)復(fù)合物、中間絲等細(xì)胞不同區(qū)域(圖2A)。在分子功能上具有與白介素1受體,雙鏈RNA,CXCR3趨化因子受體等分結(jié)合特性,這些分子部分屬于結(jié)構(gòu)分子,轉(zhuǎn)錄因子、趨化因子等，部分具有功能酶等活性(圖2B)。主要參與病毒防御反應(yīng)、抑制病毒復(fù)制、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及參與干擾素信號通路和Ikβ激酶/NF-κβ介導(dǎo)通路等生物過程(圖2C)。

而表達(dá)下調(diào)的分子則主要分布于支氣管上皮的運(yùn)動纖毛、微管、中心體、細(xì)胞器膜、細(xì)胞外泌體和細(xì)胞質(zhì)等區(qū)域(圖2D)。這些分子在功能上參與微管運(yùn)動,結(jié)合鐵離子，NADH/NAD以輔助細(xì)胞能量供應(yīng)的呼吸鏈,具有氧化還原酶,醛酮還原酶(NADP)醇脫氫酶活性等分子功能(圖2E)。主要參與了細(xì)胞氧化還原,醛代謝過程，支氣管上皮纖毛形態(tài)發(fā)生、組裝和運(yùn)動，細(xì)胞微管運(yùn)動，以及細(xì)胞分裂時的染色體分離過程(圖2F)。

The top enriched Gene Ontology (GO) terms in biological process, cellular component, molecular function and biological process of the differently expressed genes. Top 10 enriched CC (cell component) of the upregulated DEGs (A) and downregulated DEGs(D); Top 10 enriched MF (molecular function) of the upregulated DEGs (B) and downregulated DEGs (F). Top ten enriched BP (biological process) of the upregulated DEGs (C) and downregulated DEGs (F). (C) The yellow histogram represents -log10 (P-Value), and the blue line represents the total number of related genes.圖2 差異表達(dá)基因GO功能分析Fig.2 Gene ontology (GO) enrichment analyses of the differentially expressed genes

2.3差異基因參與的主要KEGG通路分析 KEGG是一個整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。用于分析分子水平的信息，尤其是基因組測序和其他高通量生成的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)，集中了解生物系統(tǒng)高級功能的實(shí)用工具。為了更明確的理解MERS-CoV對細(xì)胞功能的影響，分析了感染MERS-CoV病毒引起的細(xì)胞表達(dá)增加和表達(dá)下降兩類基因參與的KEGG通路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MERS-CoV感染上調(diào)的信號通路包括，甲型流感、單純皰疹感染和麻疹感染引起的信號通路，還參與了TNF、Toll樣受體、NOD樣受體和Jak-STAT信號通路并且能參與細(xì)胞因子與受體相互作用以及參與胞漿DNA傳感途徑(圖3A)。而病毒感染后細(xì)胞表達(dá)下降的分子則主要參與了糖酵解/糖異生通路、影響了細(xì)胞色素P450對藥物和外源物質(zhì)代謝，對藥物、碳、視黃醇、谷胱甘肽、丙酮酸等多種物質(zhì)的代謝，以及類固醇激素的合成(圖3B)。

Top ten enriched pathways of the upregulated genes(A), and the downregulated genes(B). The yellow histogram represents P-Value and the blue line represents the total number of related genes.圖3 差異基因與的KEGG通路分析Fig.3 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses of the differentially expressed genes

2.4差異基因相互作用網(wǎng)路分析和關(guān)鍵分子的篩選 細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)通過非共價鍵的相互作用形成蛋白復(fù)合體是其存在于機(jī)體每個細(xì)胞的生命活動過程中發(fā)揮作用的主要形式。研究病毒感染差異基因之間的相互作用有助于挖掘疾病機(jī)制及起關(guān)鍵作用的分子。分別以MERS-CoV病毒感染后細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增加的基因和表達(dá)降低的基因?yàn)檠芯繉ο?，分析基因間的相互作用(圖4)。結(jié)果這些分子之間存在復(fù)雜的相互作用。對相互作用網(wǎng)絡(luò)使用cytoscape軟件的cytohubba插件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)評分，發(fā)現(xiàn)：在表達(dá)上調(diào)的基因形成相互作用網(wǎng)絡(luò)中，IRF7、HLA-A、IRF1、OASL、IRF9、HLA-B、OAS1、HLA-E、HLA-F和OAS2為關(guān)鍵的hub基因。而在表達(dá)下調(diào)的基因形成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)中，CDK1、DLGAP5、TOP2A、NUSAP1、CCNB2、KIF20A、BIRC5、CCNB1、CENPF和PBK為關(guān)鍵的Hub基因(表1)。

The up-regulated (A) down-regulated (B) genes were analyzed for the interaction network圖4 差異表達(dá)基因相互作用網(wǎng)路分析Fig.4 Protein-protein interaction (PPI) network analysis of the differentially expressed gene

表1 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子Tab.1 Top 10 hub genes identified in protein-protein interaction(PPI) network of the differentially expressed gene

3 討 論

自2012年新型冠狀病毒MERS-CoV病毒由動物傳播給人類被發(fā)現(xiàn)以來，不斷有新發(fā)感染新病例的報道。該病毒具有高致病性和高致死性的特性。其致病和致死機(jī)制研分子機(jī)理雖有很多的研究但仍不完全清楚。目前已知MERS-CoV病毒主要通過其S蛋白與細(xì)胞上的DPP4受體結(jié)合感染細(xì)胞[7]，感染呼吸道，引起呼吸系統(tǒng)為主的相關(guān)疾病，包括咳嗽、發(fā)熱、呼吸急促、胸痛，嚴(yán)重者會發(fā)生呼吸衰竭。病理上以彌漫性的肺泡損傷為主要特征，免疫生化檢測顯示病毒主要存在于肺泡上皮細(xì)胞中[8]。因此，病毒對肺上皮細(xì)胞功能的影響在病毒致病中起到了重要的作用。

生物體的一切生命現(xiàn)象都與基因有關(guān)，細(xì)胞的正常的生理功能通過維持正常基因表達(dá)狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)的。研究病原體對宿主基因表達(dá)的影響，將有利于探索病原體感染宿主后病原體破壞宿主對病原體的抵抗機(jī)制，以及病原體本身對宿主細(xì)胞、組織乃至機(jī)體產(chǎn)生的病理改變，對于明確其分子機(jī)制具有重要意義。為了研究高致病性的MERS-CoV病毒的致病機(jī)制，本研究選擇了MERS-CoV標(biāo)準(zhǔn)病毒株(HCoV-EMC/2012 strain)感染原代的肺支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該數(shù)據(jù)集包含了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組5個平行對照，還含有具有0～48 h 5個不同感染時間點(diǎn)。初步分析顯示相同基因組內(nèi)信號均一性良好，提示整體實(shí)驗(yàn)誤差較小。以高質(zhì)量且豐富的表達(dá)譜數(shù)據(jù)做為研究對象，將有助于降低分析的假陽性和假陰性。

在對基因的差異表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)，病毒感染引起了宿主細(xì)胞大量基因表達(dá)改變。以P值小于0.05且差異兩倍以上為篩選標(biāo)準(zhǔn)，累計篩選到1 553個差異表達(dá)基因，其中表達(dá)增加的850個基因，表達(dá)下降的703個基因(圖1)。為了研究這些差異基因在細(xì)胞中的功能以及是否參與致病，我們對這些表達(dá)增加和下降的基因分別進(jìn)行了GO分析和KEGG信號通路分析，分析了這些基因在細(xì)胞中的位置分布，分子功能以及參與的生物學(xué)過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 差異表達(dá)的基因廣泛分布于細(xì)胞的各個組分，分子功能各異，這些分子參與了細(xì)胞多種生物學(xué)過程和信號通路。

其中表達(dá)上調(diào)的基因主要參與對病毒的防御以及對抗病毒的復(fù)制，且與細(xì)胞的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。與多種細(xì)胞干擾素通路和細(xì)胞的凋亡有關(guān)。促進(jìn)了機(jī)體免疫和炎癥的發(fā)生，這些與臨床特征相符。而細(xì)胞的抗病毒作用則是機(jī)體具有的天然對抗MERS-CoV的作用。從分析結(jié)果可知：引起免疫和炎癥反應(yīng)仍是MERS-CoV病毒對組織的主要影響，而促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的凋亡與前期文獻(xiàn)報道[9]一致，可能是肺機(jī)能障礙主要原因之一。分析結(jié)果還顯示：MERS-CoV感染引起的表達(dá)下調(diào)的基因主要參與了支氣管纖毛形成和運(yùn)動、微管運(yùn)動、糖酵解和多種物質(zhì)的代謝。纖毛是細(xì)胞游離面伸出的能擺動的長的突起，其外部有一層質(zhì)膜，內(nèi)部是由微管組成的軸絲組成。纖毛的擺動與微管的滑動有關(guān)。呼吸道大部分的腔面為有纖毛的上皮，由于纖毛的定向擺動，呼吸道可以把顆粒物和外來微生物排出。呼吸道的粘液/纖毛清除功能是除物理屏障和非特異性免疫之外的呼吸系統(tǒng)三大防御機(jī)能之一[10]。上述分析的結(jié)果提示MERS-CoV病毒感染干擾了支氣管上皮的防御功能，促進(jìn)了繼發(fā)感染對呼吸系統(tǒng)的損傷作用，另一方面無法排除的物質(zhì)可阻塞了氣道，抑制了氣體交換加劇缺氧癥狀。在缺氧的條件下，細(xì)胞的能量供應(yīng)需要借助糖酵解，而MERS-CoV又通過調(diào)控基因表達(dá)抑制了糖酵解的發(fā)生，阻斷了細(xì)胞的能量供應(yīng)，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的損傷。

為了進(jìn)一步探索起關(guān)鍵作用的hub分子，明確MERS-CoV致病的分子機(jī)制。我們分別分析了表達(dá)上調(diào)基因之間和下調(diào)基因之間的相互作用。結(jié)果提示差異基因之間存在復(fù)雜的相互作用。使用degree拓?fù)浞治龇▽ο嗷プ饔镁W(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了評分，結(jié)果確定了相互作用網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的一些分子。這些分子包括干擾素調(diào)節(jié)因子IRF7，IRF9，IRF1，寡核苷酸合成酶1，2，L，人白細(xì)胞抗原HLA-A，B，E，F(xiàn)。周期蛋白依賴性激酶(CDK1)，細(xì)胞周期素B(CCBB1, CCNB2)拓?fù)洚悩?gòu)酶(TOP2A)，核仁和紡錘體相關(guān)蛋白(NUSAP1)。這些分子對于細(xì)胞生存和免疫識別中等重要生理功能中起到了重要作用，MERS-CoV引起這些分子表達(dá)的改變在可能該病毒致病過程中起關(guān)鍵作用。

總之，MERS-CoV病毒感染宿主后會發(fā)生復(fù)雜的相互作用，一方面宿主細(xì)胞在病毒感染后啟動基因表達(dá)以抑制病毒的復(fù)制，啟動干擾素等抗病毒信號通路保護(hù)自身，另一方面病毒則通過促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡，抑制支氣管上皮纖毛的防御功能，促進(jìn)繼發(fā)感染，加劇缺氧，降低細(xì)胞能量供應(yīng)等方式對抗宿主，引起宿主的病理改變甚至于導(dǎo)致宿主死亡。這些差異基因的分子表達(dá)及其參與細(xì)胞內(nèi)的生物過程和信號通路可能在MERS-CoV與人體相互作用(包括機(jī)體抗病毒的作用和病毒致病)中起到了重要作用。這些新機(jī)制和分子的發(fā)現(xiàn)可能會為病毒感染后的病情診斷，新型靶標(biāo)的篩選和新型治療策略的制定提供幫助。

利益沖突：無