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呼腸孤病毒空斑檢測方法建立

2020-09-22 08:57竇麗麗陶曉莉李婷婷李藤菲林家鋒李永剛
關(guān)鍵詞:滴度病毒感染培養(yǎng)基

竇麗麗,陶曉莉,李婷婷,李藤菲,林家鋒,李永剛

呼腸孤病毒之前是從人和動(dòng)物的呼吸道或腸道中分離出來的。 它被稱為呼吸(R),腸(E),孤兒(O)病毒,是因?yàn)椴《镜陌l(fā)病機(jī)制尚不清楚,簡稱為呼腸孤病毒[1]。 在呼腸孤病毒科內(nèi),正呼腸孤病毒屬包括感染爬行動(dòng)物,鳥類和哺乳動(dòng)物(包括人類)的病毒。正呼腸孤病毒分為幾個(gè)亞組:第1個(gè)亞組包括哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(MRV); 第2個(gè)亞組包括禽呼腸孤病毒(ARV)以及從果蝠中分離出的納爾遜海灣病毒(NBV); 第3個(gè)亞組包括從狒拂體內(nèi)分離到的呼腸孤病毒(Baboon reovirus, BRV)[2]。正呼腸孤病毒包含一種由內(nèi)層和外層組成的雙層蛋白衣殼,正呼腸孤病毒內(nèi)衣殼層加上其封閉的病毒基因組通常被稱為病毒核心。病毒基因組由線性雙鏈RNA(dsRNA)組成,分為3個(gè)大片段(L1、L2、L3),3個(gè)中片段(M1、M2、M3),4個(gè)小片段(S1、S2、S3、S4)[3]。本文研究的方向是NBV。NBV 最初從澳大利亞果蝠中分離出來,超過 40 年的時(shí)間以獨(dú)立形式存在,且不與任何疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)。然而,最近已證實(shí)幾種NBV病毒株是人呼吸道感染的病原體,并且從一些患有急性呼吸道疾病的患者體內(nèi)分離的病原體已經(jīng)表明NBV已經(jīng)演變成可以在人類中傳播的一種人獸共患病[4-9]。2007年,日本學(xué)者將NBV從印度尼西亞巴厘島返回日本的患有急性呼吸道感染的患者中分離出來,并命名為Miyazaki-Bali/2007(MB)[10-11]。致病性NBV能引起人類急性呼吸道及腸道炎癥,并且在東南亞地區(qū)呈逐步漫延的趨勢。NBV感染者可出現(xiàn)流感樣癥狀如發(fā)熱、咳嗽和咽喉炎等[4,8,11-13],也可出現(xiàn)腹痛、水樣腹瀉和嘔吐的癥狀[12]。納爾遜海灣正呼腸孤病毒是一種具有未知人獸共患潛力的融合蝙蝠病毒[1,14-16]。以前的研究表明,NBV可以感染和復(fù)制來自其天然宿主(蝙蝠)以及人類,小鼠和猴子的各種細(xì)胞類型。在這些細(xì)胞內(nèi),NBV誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞病變效應(yīng),其特征在于細(xì)胞-細(xì)胞融合和合胞體形成[17-18]。對NBV致病機(jī)制的研究需對NBV-Miyazaki病毒株的滴度進(jìn)行定量測定??瞻咝纬稍囼?yàn)作為測定病毒滴度的金標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用,但是有些方法不易形成空斑,因此通過本實(shí)驗(yàn)建立了空斑檢測方法,為進(jìn)一步研究呼腸孤病毒病毒所需進(jìn)行的滴度檢測打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 L929細(xì)胞由錦州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代保存;BSR細(xì)胞、NBV-Miyazaki病毒株由日本大阪大學(xué)饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素均購自美國Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Hyclone公司;0.25%胰酶和中性紅染色液均購自Sigma公司;Mouse Anti-β-actin mAb購自北京中杉金橋公司;BactoTMAgar購自美國Becton, Dickinson and Company;NP-40裂解液購自上海碧云天公司;蛋白酶抑制劑(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF)、4×蛋白上樣緩沖液均購自北京索來寶科技有限公司;6×loading buffer購自大連寶生物公司;瓊脂糖購自北京百晶生物技術(shù)有限公司;Trizol·ls、HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)、Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG均購自Invitrogen公司;抗體NBV S3由錦州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2方 法

1.2.1Western Blot檢測目的蛋白 試驗(yàn)分兩組:空白對照組(不感染病毒)和實(shí)驗(yàn)組(感染病毒),每組2個(gè)孔。L929細(xì)胞8×105細(xì)胞/孔鋪6孔板,待細(xì)胞貼壁后,PBS洗3遍,NBV-Miyazaki病毒株感染細(xì)胞(對照組加PBS),置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h,PBS洗3遍,DMEM高糖培養(yǎng)基(含5% FBS、1%青鏈霉素)培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)基,用PBS洗滌細(xì)胞3次,并在含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的NP-40 buffer中裂解。將蛋白質(zhì)裂解物與4×蛋白上樣緩沖液混合,然后106 ℃變性10 min,用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),并使用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad,USA)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用NBV S3(經(jīng)ELISA檢測,效價(jià)達(dá)1∶64 000)作為一抗,HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)作為二抗檢測目的蛋白是否存在。

1.2.2NBV-Miyazaki病毒感染細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光測定 用實(shí)驗(yàn)室保存的NBV-Miyazaki病毒株感染BSR細(xì)胞在24孔板中培養(yǎng),PBS洗掉培養(yǎng)基,用4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗3遍,0.1% Triton-100室溫打孔10 min,洗掉后用PBS洗3遍,2% FBS封閉1 h,選擇一抗NBV S3,1∶250倍稀釋,37 ℃孵育1 h;PBS洗3遍;二抗為Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG,進(jìn)行1∶500倍稀釋,37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3遍,洗最后1遍時(shí)保留PBS。使用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和拍攝。

1.2.3NBV-Miyazaki病毒核酸電泳分析 提病毒RNA:病毒加Trizol·l s,靜置5 min;加入氯仿,顛倒混勻,靜置5 min;12 000 r/min離心15 min;棄上清,80%乙醇洗1次,12 000 r/min離心2 min;棄上清,室溫干燥5~10 min;加10 μL RNase-Free水。加6×Loading Buffer,混勻,加樣,進(jìn)行水平凝膠電泳。然后紫外照相。

1.2.4空斑形成試驗(yàn)測定NBV-Miyazaki病毒滴度 L929細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后,以(0.8 ~ 1)×106個(gè)/孔鋪12孔板,37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。以未感染Miyazaki的細(xì)胞作為空白對照。共5個(gè)稀釋度將病毒樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋,做2次重復(fù),每個(gè)稀釋度按圖4進(jìn)行接種,每孔250 μL病毒液,37 ℃,5% CO2條件下孵育,間隔 15 min搖晃1次;1 h后,吸去病毒液,將于37 ℃預(yù)熱的含 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液與2.4% BactoTMAgar以2∶1的比例混勻,每孔加入2 mL混合物,待細(xì)胞板中覆蓋物凝固后,倒置,37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng),觀察并記錄細(xì)胞形成典型融合病變即空斑的時(shí)間、形態(tài)和數(shù)量。病毒感染細(xì)胞7 d后,每孔加入1 mL中性紅染色液與培養(yǎng)基、BactoTMAgar的混合物,于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)過夜;次日,加入1 mL 4%甲醛固定細(xì)胞于冰箱固定一夜,棄去上層覆蓋物,觀察空斑形態(tài),記錄空斑數(shù),并按下式計(jì)算病毒滴度。 病毒滴度(PFU/mL)=(每孔平均空斑個(gè)數(shù)×病毒稀釋度倒數(shù))/每孔病毒接種量(mL)。

2 結(jié) 果

2.1Western Blot檢測NBV S3蛋白 通過Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示,結(jié)果如圖1,經(jīng)NBV-Miyazaki病毒感染的兩組均能檢測到病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NBV S3,未經(jīng)感染的兩組未能檢測到蛋白。

圖1 Western Blot檢測NBV S3蛋白Fig.1 Western Blot detection of NBV S3 protein

2.2免疫熒光檢測NBV-Miyazaki病毒感染細(xì)胞 免疫熒光顯示經(jīng)NBV-Miyazaki病毒感染的細(xì)胞有紅色熒光表達(dá),未感染病毒的細(xì)胞未檢測到非特異性的熒光標(biāo)記。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測病毒感染細(xì)胞(×200)Fig.2 Immunofluorescence detection of virus-infected cells (×200)

2.3NBV-Miyazaki病毒核酸電泳分析 為了驗(yàn)證NBV-Miyazaki病毒中核酸的成分,采用病毒RNA水平凝膠電泳。結(jié)果如圖3,病毒所含核酸為具有大中小3類共10段雙鏈 RNA(dsRNA):大基因組(L1、L2、L3),中基因組(M1、M2、M3)和小基因組(S1、S2、S3、S4)。

圖3 NBV-Miyazaki病毒核酸電泳分析Fig.3 NBV-Miyazaki virus nucleic acid electrophoresis analysis

2.4用本實(shí)驗(yàn)方法的空斑形成試驗(yàn)測定NBV-Miyazaki病毒滴度 L929細(xì)胞接種 10 倍比稀釋病毒液加入覆蓋物7 d后,每孔加入1 mL中性紅染色液與培養(yǎng)基、膠的混合物,于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)過夜;次日,加入 1 mL 4%甲醛固定細(xì)胞,于冰箱固定一夜,棄去膠,結(jié)果如圖4,觀察空斑形態(tài),記錄空斑數(shù),并按下式計(jì)算病毒滴度。 病毒滴度(PFU/mL)=(每孔平均空斑個(gè)數(shù)×病毒稀釋度倒數(shù))/每孔病毒接種量(mL)。病毒滴度為 2.2×108PFU/mL。未被病毒感染發(fā)生細(xì)胞病變區(qū)域的區(qū)域,被中性紅染成紅色;被病毒感染發(fā)生細(xì)胞病變處,不能被中性紅染色,呈現(xiàn)為無色空斑。肉眼可見:空斑呈圓形或類圓形,在12孔板內(nèi)散在分布,空斑較多時(shí)可以與鄰近空斑形成融合現(xiàn)象。顯微鏡下可觀察到形成空斑處,細(xì)胞脫落;而未形成空斑處,細(xì)胞存留。

Note:A: blank control; B ~ F: virus dilution is 10-4-10-8圖4 NBV-Miyazaki病毒空斑測定結(jié)果Fig.4 NBV-Miyazaki virus plaque assay results

3 討 論

正呼腸孤病毒屬廣泛存在于自然界的生物中,可從多種生物體內(nèi)分離,但大部分生物感染該病毒后無明顯體征[19],且對人的致病性無法確定。納爾遜海灣正呼腸孤病毒作為膜融合正呼腸孤病毒,最近被證實(shí)[4,7], 它可以從患有急性呼吸道疾病的患者中分離出來,并且這種致病性呼腸孤病毒的分離引起人們對潛伏的呼腸孤病毒傳播疾病的關(guān)注。正呼腸孤病毒根據(jù)在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞的能力分為促融合正呼和非促融合正呼[20],該病毒因含有獨(dú)特的RNA多聚酶,在宿主體內(nèi)可利用自身 RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶合成的新mRNA作為新RNA和病毒蛋白質(zhì)合成的模板[21]。病毒在復(fù)制正鏈基礎(chǔ)上,通過自身RNA多聚酶翻譯成蛋白,合成負(fù)鏈,形成雙鏈RNA分子,此后,雙鏈RNA 與蛋白外殼重新組裝,形成新的病毒粒子,致細(xì)胞破裂,在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量病毒[22]。

本實(shí)驗(yàn)所用的NBV-Miyazaki病毒株經(jīng)過Western Blot實(shí)驗(yàn)、免疫熒光檢測病毒感染細(xì)胞驗(yàn)證了是可以感染細(xì)胞的,具有病毒毒力;同時(shí)進(jìn)行了病毒RNA垂直電泳驗(yàn)證了NBV-Miyazaki病毒株的核酸成分是符合正呼腸孤病毒的基因組成分的。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的空斑形成試驗(yàn)準(zhǔn)確測定出了NBV-Miyazaki病毒株的滴度,為應(yīng)用此病毒株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。滴度測定可以讓我們知道病毒顆粒的含量,這對于之后的MOI實(shí)驗(yàn)是很方便的。這樣就不會(huì)因?yàn)榈味冗^低而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染成功率降低,也不會(huì)因?yàn)榈味冗^高而浪費(fèi)病毒或者引起宿主細(xì)胞的死亡。

在用本文方法之前進(jìn)行了幾次空斑形成實(shí)驗(yàn)。所用培養(yǎng)基為2×DMEM培養(yǎng)基,為500 mL高壓后超純水所溶解的DMEM粉末,按照說明加入碳酸氫鈉,調(diào)節(jié)pH至7.2,與2.4%濃度的BactoTMAgar以1∶1的比例混合均勻。余下步驟均與空斑形成實(shí)驗(yàn)方法相同。但重復(fù)此方法幾次結(jié)果均不佳。1×DMEM培養(yǎng)基與2.4%濃度的BactoTMAgar以1∶1的比例混合、2×DMEM培養(yǎng)基與2.4%濃度的BactoTMAgar以2∶1的比例混合均效果不佳。但用本文所述1×DMEM培養(yǎng)基與BactoTMAgar 2∶1混合所得結(jié)果如圖4,空斑清晰可見。用將目前已知的幾種測定病毒滴度的方法進(jìn)行比較,其中TCID50法限制較多,不容易觀察,而空斑法易于觀察和計(jì)數(shù);FFU法(間接免疫熒光法)需要抗體等,所耗費(fèi)用較多、成本較高,但空斑法耗費(fèi)較少、節(jié)約成本;CMC(羧甲基纖維素鈉)法不容易得到結(jié)果,方法不成熟,而空斑法適用于大多數(shù)病毒,有著大量的報(bào)道和研究;細(xì)胞病變法觀察結(jié)果主觀因素大, 而空斑法較為客觀,細(xì)胞病變法以陽性結(jié)果作為判定, 病變程度判定不準(zhǔn)確, 空斑法以斑數(shù)判定結(jié)果較準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)建立的空斑檢測方法,對于測定呼腸孤病毒滴度較為準(zhǔn)確??瞻咴囼?yàn)是測定病毒滴度的經(jīng)典方法,說服力強(qiáng),已經(jīng)有多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道和記載。每一個(gè)空斑代表一個(gè)感染性病毒顆粒的繁殖,被破壞的死細(xì)胞不能被染色從而呈現(xiàn)白斑。該方法簡單、經(jīng)濟(jì)、方便,可準(zhǔn)確計(jì)算出病毒感染的單位數(shù)量,可用于基礎(chǔ)研究,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可長期保存。因此,綜上所述,本文空斑檢測方法成功建立,為后續(xù)進(jìn)一步研究呼腸孤病毒奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突:無

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