臧旭鵬，胡 群，吳珍芳，蔡更元，黃思秀，洪林君

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

窩產(chǎn)仔數(shù)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，從排卵到受精、附植，胚胎生長過程中的每一步都會影響窩產(chǎn)仔數(shù)，而附植期對窩產(chǎn)仔數(shù)的影響最大。在排卵和受精過程完成后，豬胚胎產(chǎn)前死亡率在20%～46%[1]，胚胎發(fā)生死亡主要在胚胎附植期[2]。在胚胎附植期，妊娠第12 天是影響胚胎存活的關(guān)鍵時間點，中國太湖豬在其妊娠第12 天時胚胎具有良好的附植狀態(tài)，降低了胚胎最終死亡率[3]。胚胎死亡率越高，其窩產(chǎn)仔數(shù)越少。因此，研究調(diào)控附植期胚胎死亡的關(guān)鍵基因及其分子機(jī)制具有重要的理論和實踐意義。本文綜述了豬附植期胚胎發(fā)育過程及影響豬胚胎形態(tài)轉(zhuǎn)變關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步研究豬早期胚胎附植過程調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 豬附植期胚胎發(fā)育過程

豬早期胚胎的正常發(fā)育和妊娠的成功建立伴隨著相關(guān)基因的表達(dá)，隨著胚胎的發(fā)育，不同的基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，包括周期性的表達(dá)等，該階段共涉及大約10 000 種基因表達(dá)模式[4]。在早期妊娠過程中，豬胚胎在附植到子宮表面（即子宮內(nèi)膜腔上皮）前會經(jīng)歷一個形態(tài)學(xué)過程上的轉(zhuǎn)變，這個轉(zhuǎn)變會使胚胎與母體建立相互聯(lián)系時有一個最大的接觸面積，這對于母體妊娠的識別和胚胎在附植前的正常發(fā)育至關(guān)重要，是豬胚胎成功附植、母體成功妊娠的必要前提條件[5]。此外胚胎與母體子宮接觸面積增大也促進(jìn)了胚胎從子宮獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)[2]。豬胚胎從成功受精形成合子后開始正常發(fā)育，大約在受精后的第60～72 小時即發(fā)育到桑葚胚階段，胚胎開始進(jìn)入子宮。在妊娠的第5 天左右發(fā)育至囊胚階段，并在第8天左右開始孵化[6]。孵化后，豬胚胎繼續(xù)生長，在第10 天左右形成一個直徑為2～6 mm 的球形胚胎，隨后轉(zhuǎn)變成卵圓形并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楣苄闻咛7]，在妊娠第11～12 天，管形胚胎在1～2 h 內(nèi)迅速伸長轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長的絲狀胚胎，長度為100～150 mm（圖1）[8]。胚胎的伸長涉及外胚層的分化和中胚層的生長，滋養(yǎng)外胚層接頭復(fù)合物的松動使得細(xì)胞可以相互移動，有利于內(nèi)胚層細(xì)胞的遷移和重塑，進(jìn)而促進(jìn)絲狀胚胎的形成[9]。之后胚胎繼續(xù)發(fā)育，不過此時的胚胎不會再像第11～12 天時那樣迅速伸長，而是進(jìn)入一個相對緩慢的伸長發(fā)育階段，直到第18 天左右胚胎與子宮上皮內(nèi)膜相接觸，引發(fā)上皮絨毛膜胎盤的形成[10]。豬胚胎的快速伸長、形態(tài)學(xué)上發(fā)生劇烈轉(zhuǎn)變的階段，被稱之為胚胎的形態(tài)轉(zhuǎn)變期。由于豬胚胎從球形到絲狀胚胎的形態(tài)轉(zhuǎn)變主要靠滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和重組，因此又被稱為豬胚胎滋養(yǎng)層的快速伸長期[11]。

2 調(diào)控豬胚胎形態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵基因

豬胚胎的成功附植受到一系列生物學(xué)過程的調(diào)控，包括豬胚胎發(fā)育及形態(tài)轉(zhuǎn)變，胚胎-母體相互作用以及母體妊娠識別[12-14]。其中，豬胚胎形態(tài)轉(zhuǎn)變是影響豬胚胎能否成功附植的關(guān)鍵，近年來，調(diào)控胚胎形態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如成纖維細(xì)胞生長因子4（Fibroblast Growth Factor 4，F(xiàn)GF4）、白細(xì)胞介素-1β亞型2（IL1B2）以及干擾素（IFNs）基因。

2.1FGF4基因 FGF4 是由外胚層（Epiblast）產(chǎn)生[15]的一個多能性生長因子，其化學(xué)成分是一個小的多肽，屬于肝素結(jié)合生長因子家族成員[16]，能夠誘發(fā)多種類型的組織和細(xì)胞完成不同的生物學(xué)功能，被證實能夠促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖[17]，在妊娠第12 天時表達(dá)量增加[18]。研究表明，胚胎的生長伴隨著旁分泌信號所引發(fā)的正反饋回路（Feed-Back Loop），該反饋回路可以促進(jìn)細(xì)胞的特定分化[19]。FGF4 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone Morphogenesis Protein 4，BMP4）都是誘導(dǎo)型信號，參與正在發(fā)育的胚胎外胚層和胚外胚層（Extraembryonic Ectoderm，ExE）之間的信號交流[20]。FGF4 在滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞上的受體成纖維細(xì)胞生長因子受體2（Fibroblast Growth Factor Receptor 2，F(xiàn)GRFR2）的激活是胚胎或子宮內(nèi)膜通過磷脂酰肌醇3-激酶/AKT 通路來轉(zhuǎn)導(dǎo)FGF4信號完成的，AKT 信號通路中p-AKT、p-P90RSK、p-RPS6 蛋白的增加與滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞的遷移活動相關(guān)聯(lián)，對胚胎發(fā)育至關(guān)重要[21]。外胚層產(chǎn)生的FGF4 與滋養(yǎng)外胚層上FGRFR2 的結(jié)合，會誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK/ERK）的磷酸化來激活MAPK/ERK，這將觸發(fā)一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路反應(yīng)，從而刺激CDX2 的表達(dá)，誘導(dǎo)中胚層細(xì)胞（Mesoderm）產(chǎn)生BMP4[22]。AKT 和MAPK 細(xì)胞信號通路的傳導(dǎo)，能夠調(diào)節(jié)脂聯(lián)素的表達(dá)[23]，涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、細(xì)胞黏附等過程來影響胚胎的附植[24]。CDX2 將和Eomes、ELF5 一起構(gòu)成1 個基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的一部分，能夠促進(jìn)胚外胚層（ExE）滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)生[25]。CDX2 也將促進(jìn)BMP4 的表達(dá)[26]，通過反饋回路，反饋回外胚層來誘導(dǎo)中胚層的分化[27]，由新生的中胚層細(xì)胞來產(chǎn)生BMP4，產(chǎn)生的BMP4 將激活CDX2 和ELF5，使得滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中SMAD1/5/8磷酸化增加，活化發(fā)揮作用[20]。敲除FGF4和FGFR2后，胚胎不會形成內(nèi)胚層細(xì)胞系，同時該時期FGF4-FGFR2信號體系的表達(dá)，與胚胎附植期死亡率最高這一時間吻合，表明了FGF4-FGFR2 信號體系對胚胎發(fā)育的重要性[28-29]。

圖1 妊娠過程中豬胚胎發(fā)育模式圖

2.2IL1B2基因 促炎反應(yīng)因子會作用于妊娠期間的胚胎和子宮內(nèi)膜，是影響妊娠過程中胚胎附植失敗和死亡的一個主要因素[30]。而白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β）參加機(jī)體促炎反應(yīng)（Proinflammatory），是一個主要的促炎反應(yīng)因子，在附植前期，由囊胚釋放，可以通過促進(jìn)胚胎與子宮內(nèi)膜的接觸和附植來促進(jìn)妊娠的建立[31]。研究發(fā)現(xiàn)，豬胚胎快速伸長期間，滋養(yǎng)層IL1B表達(dá)量增加，即胚胎在形態(tài)學(xué)上從管形到絲狀階段的轉(zhuǎn)變過程中，IL1BmRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)豐度明顯增加，出現(xiàn)了一個表達(dá)和分泌峰，但當(dāng)滋養(yǎng)層快速伸長期結(jié)束時，IL1B表達(dá)量會出現(xiàn)一個瞬時的降低，較之前大約降低了2 000 倍[32]。IL1B基因在豬胚胎中表達(dá)量倍增是由于豬胚胎中表達(dá)了1 個IL1B的新亞型IL1B2。IL1B1與IL1B2對比發(fā)現(xiàn)，它們都有7 個外顯子，分布于第3號染色體上，但I(xiàn)L1B2中包含1 個可變外顯子能夠提供不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。研究通過把IL1B分別從妊娠12 天的豬胚胎和周邊血液白血球（PBLs）的mRNA 中克隆分離出來，發(fā)現(xiàn)了只有在豬胚胎中才會表達(dá)這個新亞型（IL1B2）[33]。通過使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除豬胚胎中的IL1B2基因，發(fā)現(xiàn)胚胎滋養(yǎng)層不會出現(xiàn)伸長，同時胚胎芳香酶的表達(dá)和雌激素分泌減少，表明了IL1B2可能涉及胚胎妊娠建立過程中所需雌激素在時空上的合成，同時，其能夠調(diào)節(jié)胚胎的伸長和與子宮表面相接觸時子宮內(nèi)膜的促炎反應(yīng)[34]。白細(xì)胞介素1（IL1）的信號系統(tǒng)很復(fù)雜，共含白細(xì)胞介素1 及其受體共22 種分子，包括促炎因子IL1B 和IL1A、功能性受體IL1RⅠ、誘餌受體IL1RⅡ、拮抗分子IL1RA 和IL1 受體輔助蛋白IL1RAP 等[35]。IL1RⅠ和IL1RAP Toll 樣受體的并置激活了1 個第二信使蛋白相互作用的級聯(lián)反應(yīng)，此時附植前期豬胚胎表達(dá)的IL1B 新亞型（IL1B2）能夠激活子宮上皮表面的核因子κB（Nuclear Factor-kappa B，NFKB）。核因子κB 是一個轉(zhuǎn)錄因子，由保守亞基組成，能夠控制先天的和自適應(yīng)的免疫反應(yīng)[36]，這就如同在豬妊娠建立期間創(chuàng)造了一個促炎反應(yīng)的微環(huán)境[33]，通過IL1B2 的激活，NFKB 可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)超過100種基因的表達(dá)[37]，這對哺乳動物妊娠的建立是必要的[38]。

2.3IFNs基因 在胚胎快速伸長期結(jié)束后，IL1B2基因的表達(dá)量迅速減少，在妊娠的第12～20 天，豬胚胎滋養(yǎng)外胚層分泌Ⅰ類型的干擾素-δ（IFND）和Ⅱ類型的干擾素-γ（IFNG），其在妊娠第14～16 天時會達(dá)到一個最大的分泌水平[5]，與球形胚胎相比，第14 天的絲狀胚胎中IFNG 的mRNA 表達(dá)量增加了567 倍[39]。與反芻動物胚胎產(chǎn)生的干擾素-τ（IFNT）不同，IFNT 會抑制子宮內(nèi)膜產(chǎn)生PGF2α，作為反芻動物的妊娠識別信號[40]，其與豬妊娠過程中產(chǎn)生的雌激素的功能相一致，但豬胚胎產(chǎn)生的IFNs 并不表現(xiàn)出抑制黃體溶解的作用[41]。Ⅰ類型的IFNs，通過與它們的異質(zhì)二聚體Ⅰ類型IFN 受體（包括IFNAR1 和IFNAR2）結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號進(jìn)入細(xì)胞[42]。IFNAR1 和IFNAR2 的mRNA 在子宮內(nèi)膜中表達(dá)，妊娠第12 天時表達(dá)豐度最大，雌二醇（Estradiol）和IL1B 可以影響其在時空上的表達(dá)量[43]。IFND 通過和IFNAR2 亞基相互作用，與IFNAR1 鏈一起形成1 個三聚體復(fù)合物，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)[44]。由豬胚胎分泌的雌激素、IFND 和IFNG 可以同子宮腔和基質(zhì)中激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子1（Signal Transducer and Activator of Transcription 1，STAT1）一起誘導(dǎo)細(xì)胞通路，來完成滋養(yǎng)層的附植和對母體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[45]?；|(zhì)細(xì)胞中STAT1 的激活會誘導(dǎo)胚胎來表達(dá)IFNG，胚胎在附植期的死亡與IFNG 表達(dá)的缺失，使得其過早與雌激素接觸有關(guān)[46]。而IFNG 作為一個滋養(yǎng)層信號，可以誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞來表達(dá)一些趨化因子，包括涉及子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)層之間信號交流的CCL2、CCL5、CCL11、CXCL12 和涉及胚胎-母體之間免疫容受環(huán)境的CXCL9 和CXCL10 等[47]。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，在早期妊娠過程中，豬胚胎為了成功完成與母體的識別和附植，其經(jīng)歷了一個在形態(tài)學(xué)上從球形到絲狀的劇烈變化，以獲得足夠的表面積來與母體子宮內(nèi)膜相接觸，進(jìn)行妊娠信號的交換及營養(yǎng)物質(zhì)的獲取。在胚胎形態(tài)轉(zhuǎn)變期，成纖維細(xì)胞生長因子4、白細(xì)胞介素-1β亞型2 和干擾素3 個關(guān)鍵基因影響胚胎的正常發(fā)育及胚胎形態(tài)的成功轉(zhuǎn)變，敲除這些基因?qū)?dǎo)致囊胚內(nèi)胚層的不分化、滋養(yǎng)層不能伸長等，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育失敗而死亡。雖然目前國內(nèi)外的學(xué)者對影響胚胎附植期形態(tài)轉(zhuǎn)變的相關(guān)基因有了一定研究，但對于具體的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚，只有較少的候選基因被鑒定出來，對該階段導(dǎo)致高胚胎死亡率的原因仍有待進(jìn)一步了解。因此，深入研究豬胚胎附植階段基因的動態(tài)轉(zhuǎn)錄過程及其調(diào)控機(jī)制將是今后的研究重點，若能鑒定出顯著影響胚胎附植成功率的功能基因，可為高繁殖力豬種的培育提供育種基因素材。