杜嘉偉 ，張薇依，李安奇，蘇曉彤，杜鑫澤，褚瑰燕，昝林森,2，王洪寶,2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100）

牛作為家畜飼養(yǎng)已有幾千年歷史[1]，與豬、雞相比，?？梢韵拇罅康那啻诛暳虾娃r(nóng)副產(chǎn)品，是國家發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)的重要畜種。目前，地方黃牛仍然是我國牛肉生產(chǎn)的主要品種，這些品種普遍具有耐粗飼、抗逆性強、肉質(zhì)細(xì)嫩等優(yōu)點，但存在生長速度慢、胴體產(chǎn)肉少、優(yōu)質(zhì)牛肉切塊率低、脂肪沉積不理想等缺陷[2]。為增強我國肉牛產(chǎn)業(yè)的市場競爭力，育種工作者需充分有效地利用國內(nèi)現(xiàn)有的黃牛資源優(yōu)勢，通過現(xiàn)代分子育種技術(shù)提高肉牛生產(chǎn)性能和改善牛肉生產(chǎn)品質(zhì)，加快對地方黃牛的改良步伐[3]。

骨骼肌是哺乳動物身體結(jié)構(gòu)中的重要組成部分，參與機體的運動和能量代謝。骨骼肌收縮系統(tǒng)位于肌肉的細(xì)肌絲內(nèi)，該系統(tǒng)主要包括鈣蛋白酶復(fù)合體（Tropinon，Tn）、纖維蛋白原（Tropomyosim，Tm）和肌動蛋白（Actin）。鈣蛋白酶復(fù)合體由肌鈣蛋白C（TnC）、肌鈣蛋白I（TnI）和肌鈣蛋白（TnT）3 種亞基組成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人骨骼肌纖維和心臟小梁TnC 蛋白缺失時，肌纖維張力和最大收縮力明顯不同，表明TnC 蛋白在肌纖維收縮過程中起著相當(dāng)重要的作用[5]，而骨骼肌的收縮會影響肌肉的嫩度、剪切力、熟肉率等[4]。TnC 包含TNNC1（Troponin C，Slow Skeletal Muscle）和TNNC2（Troponin C，F(xiàn)ast Skeletal Muscle）2 種蛋白。TNNC2 為骨骼肌快肌肌鈣蛋白，已有研究表明該基因與關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端畸形疾病的發(fā)生有著必要的聯(lián)系，另外該基因還參與心臟信號傳導(dǎo)及鈣信號傳導(dǎo)途徑[6]。TNNC2 可通過本身具有的Ca2+結(jié)合位點，與Ca2+結(jié)合后引起肌肉收縮并釋放能量和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），CREB 通過啟動核內(nèi)的c-myc 和其他原癌基因單獨或協(xié)同調(diào)控肌蛋白的形成，從而開始肌纖維的生長分化[7]。肌鈣蛋白復(fù)合物位于橫紋肌細(xì)絲上，是調(diào)節(jié)肌肉收縮和松弛的鈣敏感開關(guān)，它由3 個亞基組成：肌鈣蛋白C（TnC），鈣結(jié)合亞基；肌鈣蛋白T（TnT），其主要功能是使復(fù)合物與原肌球蛋白結(jié)合；肌鈣蛋白I（TnI），則屬于抑制亞基[8]。目前對于TNNC2基因在農(nóng)業(yè)動物上的研究較少，其在牛上的表達(dá)特性和可能功能尚未被闡明，因此本研究選取TNNC2基因為目標(biāo)基因，以秦川牛為研究對象對其進(jìn)行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育種實踐中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物采樣 本實驗樣本均來自西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心的肉牛良種繁育場，將新生秦川牛（3 日齡）和成年秦川牛（24 月齡）各3 頭作為研究對象，屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、腎周脂肪、皮下脂肪、背最長肌等組織，液氮冷凍后轉(zhuǎn)存-80℃冰箱長期保存。新生牛背最長肌組織用于后續(xù)成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

1.1.2 實驗器材與儀器設(shè)備 10 cm 培養(yǎng)皿（NEST）、1.5 mL/200 μL 離心管（NEST）、PBS 緩沖液（Thermo Fisher）、酒精燈、槍頭（Eppendorf）、96孔板封口膜（Thermo Fisher）、Trizol （ThermoFisher）、異丙醇、胰蛋白酶、氯仿、DEPC 水（ThermoFisher）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）、實時熒光定量試劑盒（Takara）、上下游引物（西安擎科）、6 孔板（NEST）等。實時定量PCR 儀（ABI7500）、酶標(biāo)儀（Tecan Austria GmbH 5082）、通風(fēng)櫥、5811R離心機（Eppendorf）、5424R 離心機（Eppendorf）、制冰機、QL-901 旋渦震蕩儀、小型離心機、37℃恒溫培養(yǎng)箱以及2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 000 μL 定量移液槍等。

1.2 實驗方法

1.2.1 秦川牛各組織總RNA 的提取和cDNA 的合成 采用傳統(tǒng)的Trizol 法提取各組織的總RNA。提取過程為：取少量組織樣于研缽中，加入液氮反復(fù)研磨；加入500 μL Trizol，繼續(xù)研磨混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，室溫放置15 min 后4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清，按Trizol 總體積1/5 的量加入氯仿，劇烈振蕩15 s 后室溫靜置5 min；4℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清加入等體積的異丙醇充分混勻后室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；棄上清，加入1 mL 4℃預(yù)冷的75%乙醇，4℃、8 000 r/min離心5 min；室溫干燥2～5 min；用適量RNase-free 水溶解RNA，測定濃度后于-80℃保存?zhèn)溆?。使用酶?biāo)儀（Tecan Austria GmbH 5082）檢測所提取總RNA 的純度及濃度，并使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。以提取的RNA 為模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（TaKaRa，code No.RR047Q）操作步驟進(jìn)行cDNA 的合成。

1.2.2 秦川牛成肌細(xì)胞培養(yǎng)及cDNA 樣品準(zhǔn)備 將秦川牛成肌細(xì)胞復(fù)蘇后采用生長培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)20%的牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%的雙抗的F-12/DMEM）培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%左右融合時使用分化培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)2%的馬血清和體積分?jǐn)?shù)1%的雙抗的F-12/DMEM）培養(yǎng)，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基，于分化第0、2、4、6、8 天取細(xì)胞樣品，采用Trizol 法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA[9]。

1.2.3 實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 已公布的牛TNNC2基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異實時熒光定量引物，送交西安擎科有限公司合成。以β-Actin 基因作為內(nèi)參進(jìn)行實時熒光定量PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：TB Rreen Ⅱ 7.5 μL（終濃度1X），cDNA 1.4 μL（終濃度100 ng/μL），上下游引物各0.3 μL（終濃度0.2 μmol/L），加RNase free H2O 補足體系。于Bio-Rad 熒光定量PCR 儀（CFX Connect）上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)；采集熔解曲線熒光信號和達(dá)到峰值循環(huán)數(shù)Ct 值。采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具體公式為：△Ct1=待測組目標(biāo)基因Ctmean－待測組β-ActinCtmean；△Ct2=基測組目標(biāo)基因Ctmean－基準(zhǔn)組β-ActinCtmean；RQ=2-(△Ct1-△Ct2)=2-△△Ct，其中，Ctmean代表3 次重復(fù)的平均值，RQ（Relative Quantification）值代表實驗待測組目的基因的表達(dá)相對于基準(zhǔn)組變化的倍數(shù)[10]。

1.3 統(tǒng)計分析TNNC2基因在不同組織中以及肌細(xì)胞不同分化時期的表達(dá)差異采用單因素方差分析進(jìn)行計算，多重比較以表達(dá)量最低組織或誘導(dǎo)分化第0 天為對照，使用LSD 方法進(jìn)行。TNNC2基因在新生牛與成年牛特定組織中的表達(dá)差異分析用t檢驗進(jìn)行計算，P<0.05 表示差異顯著。

表1 實時定量PCR 引物序列

2 結(jié)果

2.1 成年牛不同組織TNNC2基因相對表達(dá)量的檢測本實驗中得到的TNNC2基因在成年牛不同組織中的表達(dá)量是以肝組織中TNNC2基因的相對表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)（單位1），計算獲得的各組織相對水平，研究結(jié)果如圖1 所示，TNNC2基因在各組織中廣泛表達(dá)，但表達(dá)量不盡相同。其中TNNC2基因在肝臟中表達(dá)量最低，在瘤胃、網(wǎng)胃、腎周脂、腎臟等組織中表達(dá)量依次增多，但在這些組織中的整體表達(dá)水平依舊較低。該基因在成年牛背最長肌中的表達(dá)量極顯著高于其他組織。

圖1 成年秦川牛TNNC2 基因在不同組織中的表達(dá)量

2.2 新生牛不同組織TNNC2基因相對表達(dá)量的檢測 本實驗得到的TNNC2基因在新生牛不同組織中表達(dá)量是以肺臟組織中TNNC2基因的相對表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)（單位1），計算獲得的各組織相對水平，結(jié)果如圖2 所示，TNNC2基因在新生牛肺臟組織中的相對表達(dá)量最低，在瘤胃、腎臟、小腸、網(wǎng)胃、大腸、瓣胃、脾臟、腎周脂、皺胃、心臟中的表達(dá)量依次增加，但整體處于低表達(dá)水平，而在后腿肌和背最長肌中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織。

圖2 新生秦川牛TNNC2 基因在不同組織中的表達(dá)量

2.3 成年牛與新生牛重要組織相對表達(dá)量的比較 如圖3 所示，TNNC2基因在成年秦川牛背最長肌、大腸、肺臟中的相對表達(dá)量極顯著高于新生秦川牛，在成年秦川牛皮下脂肪、網(wǎng)胃、瓣胃、腎臟、心臟、腎周脂等組織中的表達(dá)量顯著高于新生秦川牛，而在瘤胃和脾臟中表達(dá)差異不顯著。

圖3 成年牛與新生牛重要組織相對表達(dá)量的比較

2.4TNNC2基因在成肌細(xì)胞不同分化天數(shù)的表達(dá)規(guī)律的測定TNNC2基因在成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同天數(shù)的相對表達(dá)量是以第0 天作為標(biāo)準(zhǔn)得出的結(jié)論。由圖4 可知，從整體趨勢上來看，TNNC2基因在成肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)量是上升的，但在第6 天TNNC2基因的表達(dá)量稍有下降，該基因的表達(dá)趨勢與成肌細(xì)胞的分化程度相一致，由此推測TNNC2是與肌細(xì)胞分化相關(guān)的基因，后續(xù)研究可聚焦于其對于牛肌細(xì)胞增殖分化的影響。

圖4 TNNC2 基因在肌肉細(xì)胞不同天數(shù)的表達(dá)規(guī)律

3 討 論

目前，有關(guān)TNNC2基因功能的研究文獻(xiàn)很少，已有研究證實TNNC2基因不僅對肌肉發(fā)育有影響，同時還與一些疾病的發(fā)生相關(guān)。如TNNC2基因與人類的先天性肌病有關(guān)，當(dāng)TNNC2基因發(fā)生顯性突變時將伴有聲帶麻痹及眼肌麻痹等臨床癥狀[11]。另外，在女性妊娠過程中，TNNC2基因突變將引起呼吸系統(tǒng)受損、羊水過少等臨床癥狀[12]。農(nóng)業(yè)動物上的研究發(fā)現(xiàn)，TNNC2可以作為一個豬肉品質(zhì)相關(guān)的候選基因[13]。綿羊上的研究表明，TNNC2基因不同基因型與綿羊肉的剪切力、大理石紋評分顯著相關(guān)，說明TNNC2 等位基因?qū)d羊肉嫩度有正向影響[14]。

本實驗主要采用qRT-PCR 技術(shù)檢測了TNNC2基因在新生秦川牛和成年秦川牛不同組織中的表達(dá)模式，同時檢測了該基因在成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化后不同天數(shù)的表達(dá)規(guī)律，研究結(jié)果初步揭示了TNNC2基因的表達(dá)特性及規(guī)律。無論在新生牛還是成年牛中，TNNC2在背最長肌中的表達(dá)量都極顯著高于其他組織，其在成年牛背最長肌中的表達(dá)量約為新生牛的3 倍，說明其對肌肉的生長發(fā)育可能具有重要的調(diào)控作用。除了肌肉組織（骨骼肌和心肌），TNNC2在新生牛其他組織中的表達(dá)水平都很低，進(jìn)一步證實了該基因與肌肉發(fā)育可能存在密切關(guān)系。隨著秦川牛的生長發(fā)育，TNNC2基因在各個組織中的表達(dá)量均有所提高，但整體表達(dá)水平依然不高，推測其可能原因是內(nèi)臟組織（如脾、腎等）均為非肌肉組織，TNNC2不參與其行使功能。有意思的是，TNNC2基因在成年牛肺臟中的表達(dá)水平極顯著高于新生牛，提示該基因可能與牛的呼吸功能有關(guān)，這與Donkervoort 等研究結(jié)果一致[12]。TNNC2基因在新生牛和成年牛大腸中的表達(dá)量差異極顯著，可能的原因還需進(jìn)一步研究。

本研究得到了TNNC2基因在成肌細(xì)胞分化不同天數(shù)的表達(dá)規(guī)律：從總趨勢上來看，雖然在分化至第6 天時TNNC2基因的表達(dá)量稍有下降，但TNNC2在成肌細(xì)胞分化過程中的表達(dá)量整體呈上升趨勢，提示該基因可能促進(jìn)肌細(xì)胞的分化，可嘗試在肌細(xì)胞中對該基因進(jìn)行過表達(dá)或干擾，進(jìn)一步闡明其對牛肌細(xì)胞增殖和分化的影響。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，TNNC2基因在秦川?？旒〗M織（如背最長肌、后腿肌等）中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，同時隨著牛成肌細(xì)胞的不斷分化，該基因的表達(dá)水平逐漸升高，推測TNNC2基因?qū)η卮ㄅ９趋兰〉纳L發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，可將其作為影響肉牛生長和肉質(zhì)性狀的候選基因加以深入研究。