李英蓮

(山東省血液中心 檢驗科, 山東 濟南, 250014)

經(jīng)輸血傳播疾病的病原體檢測“窗口期”是血液篩查中的難題，核酸檢測可以有效縮短乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)的檢測“窗口期”，提高輸血安全性。美國自1994年開始研究用于血液篩查的核酸檢測技術(shù)(NAT), 2001年9月美國食品和藥物管理局(FDA)批準了首個用于原料血漿篩查的人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)NAT試劑和HCV NAT試劑; 2002年2月FDA批準了首個用于檢測供者全血樣本的NAT試劑; 2005年，美國FDA開始強制要求血液中心和血液制品生產(chǎn)企業(yè)采用批準的NAT試劑盒進行血源篩查，強制進行NAT篩查的病毒有HIV-1和HCV[2]。為了解NAT在血液篩查中的應(yīng)用效果，本研究分析2015—2017年山東省濟南地區(qū)無償獻血者血液篩查情況，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

收集2015年1月—2017年12月山東省血液中心采集的無償獻血者樣本282 456份。每位獻血者采血時分別留取3管血液標本，每管5 mL; 2管采用EDTA-K2真空抗凝管留取，第1管用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA), 第2管用于谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及血型檢測; 第3管采用帶分離膠的EDTA-K2真空抗凝管(無酶、無熱源)留取，用于NAT檢測。核酸檢測管于采血后4 h內(nèi)完成離心, 2～8 ℃冰箱保存, 48 h內(nèi)進行核酸檢測。

1.2 儀器與試劑

STAR全自動加樣儀(瑞士Hamilton公司), FAME酶免全自動檢測分析儀(瑞士Hamilton公司), S201全自動核酸檢測系統(tǒng)(美國羅氏診斷)，上海浩源核酸檢測系統(tǒng)。ELISA檢測試劑(法國伯樂、美國雅培、上?？迫A、廈門新創(chuàng)、北京萬泰、珠海麗珠、北京金豪)，核酸聯(lián)合檢測試劑(美國羅氏診斷公司，上海浩源公司)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA: 使用2種 ELISA試劑進行檢測, 2種試劑均無反應(yīng)性判為無反應(yīng)性, 2種試劑均有反應(yīng)性判為有反應(yīng)性; 若僅有1種試劑有反應(yīng)性，則使用2種試劑做雙孔復(fù)試，復(fù)試結(jié)果只要有1孔為反應(yīng)性就判為有反應(yīng)性。

1.3.2 NAT檢測: 采用核酸提取擴增檢測系統(tǒng)對ELISA無反應(yīng)性與單試劑反應(yīng)性樣本進行6混樣(羅氏診斷)或者8混樣(上海浩源)模式檢測，檢出的反應(yīng)性混樣做拆分試驗，單檢結(jié)果為反應(yīng)性的樣本為NAT反應(yīng)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料分別采用百分數(shù)和千分數(shù)表示，采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2015—2017年濟南地區(qū)無償獻血者血液樣本ELISA檢測結(jié)果

282 456份無償獻血者樣本中，檢測出1 638例ELISA[乙肝表面抗原(HBsAg)、抗丙型肝炎病毒(抗-HCV)、抗人類免疫缺陷病毒/人類免疫缺陷病毒(抗-HIV/HIV)]反應(yīng)性樣本，反應(yīng)性檢出率為0. 58%, 相鄰2個年度檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

2.2 2015—2017年濟南地區(qū)無償獻血者血液樣本NAT檢測結(jié)果

280 818份ELISA無反應(yīng)性樣本中，檢測出NAT反應(yīng)性105份，相鄰2個年度檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表2。

表1 2015—2017年濟南地區(qū)無償獻血者血液樣本ELISA檢測結(jié)果比較

表2 2015—2017年濟南地區(qū)獻血者ELISA檢測無反應(yīng)性樣本的NAT結(jié)果比較

3 討 論

目前，中國血液篩查的NAT主要為逆轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)(TMA)和實時熒光PCR技術(shù)[1], 研究[2]表明這2種核酸篩查系統(tǒng)的靈敏度、特異性和NAT陽性檢出率均存在差異。核酸檢測的基本步驟包括核酸提取、擴增和檢測。本中心實驗室使用的美國羅氏和上海浩源核酸檢測系統(tǒng)均采用了聚合酶鏈反應(yīng)的PCR技術(shù)，這種技術(shù)具有高敏感性、高通量和高度自動化的特點，可檢出血樣本中極微量的病毒核酸，可以將HBV、HCV和HIV檢測的“窗口期”分別由56、70、22 d縮短至41、12、11 d[3]。本中心對 280 818份經(jīng)2種ELISA試劑檢測均無反應(yīng)性的獻血者樣本進行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3項聯(lián)檢，檢出105例NAT反應(yīng)性樣本，陽性反應(yīng)率為0.37‰, 低于上海的0.63‰[4]、重慶的1.06‰[5], 同時也低于本中心于2010—2012年檢測的總反應(yīng)性率0.67‰。

本研究中, HBV DNA 反應(yīng)性獻血者占據(jù)總NAT 反應(yīng)性人群的98.10%, 作者分析原因可能為: ① 中國是乙肝感染大國，1～59歲人群HBsAg攜帶率達到了7.18%[6], 西部地區(qū)HBsAg攜帶率高于東部地區(qū)，由于不同地區(qū)的乙肝流行率不同，隱匿性乙肝病毒感染率自然也會存在差異; ② 不同廠家核酸試劑的檢測靈敏度不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果存在差異; ③ 同一地區(qū)不同時間獻血人群的乙肝病毒感染率也不同; ④ 本中心自2010年開始對濟南地區(qū)部分獻血者進行核酸檢測，2012年實現(xiàn)全部獻血者核酸檢測，隨著獻血人群中的隱匿性乙肝感染者被檢出屏蔽，逐步降低了隱匿性乙肝感染者參與獻血的概率，尤其是減少了固定獻血者中乙肝隱匿性感染者的人數(shù)。

研究[7]發(fā)現(xiàn), 70%的HCV、90%的HBV及HIV漏檢是由于檢測“窗口期”導(dǎo)致的。本研究中, 2015與2016年、2016與2017年3個項目的ELISA反應(yīng)性率均有顯著差異，說明3個項目獻血人群的感染率并不會隨著時間延長而降低，而是不固定的，這種現(xiàn)象也與獻血人群采前快檢時查體工作人員的工作效果相關(guān)。若查體工作人員認真履行采前快速檢測程序，對全部有意向獻血者按照規(guī)程進行HBsAg快速檢測，篩查出來的HBsAg反應(yīng)性獻血者自然會減少。HIV在血液中的標志物有HIV-Ab、HIV-Ag、HIV-RNA, 這3類標志物在感染者血液中出現(xiàn)的時間分別為22、(8～10)、7 d[8-10], 目前國內(nèi)采供血機構(gòu)的HIV篩查試驗是以檢出這3類標志物作為HIV反應(yīng)性標準。2015年底，全國血站對HIV進行NAT 檢測，進一步使HIV檢測“窗口期”縮短至平均11 d(多樣本混檢)[11-13]。2017年，本中心檢測出1例HIV ELISA無反應(yīng)性而HIV RNA反應(yīng)性的獻血者，同樣在2012年也檢測出1例[14-15], 2例HIV ELISA“窗口期”HIV感染者的檢出證實了核酸檢測在HIV項目上的重要性和必要性。2017年，這例HIV RNA反應(yīng)性獻血者在檢出之前已捐獻血液117次，是一位固定獻血者，最后這次捐獻了2個單位的血小板，且距離上次捐獻合格血液的時間僅有37 d, 進口HIV ELISA試劑和國產(chǎn)ELISA試劑檢測均為無反應(yīng)性，同樣證實HIV RNA檢測確實比第4代進口酶免試劑還要短。

本研究中, 2016年羅氏核酸檢測系統(tǒng)檢出1例HCV RNA反應(yīng)性樣本[循環(huán)閾值(Ct)為39.7], 同時也是HBV DNA反應(yīng)性(Ct值為29.5), 該獻血者為初次獻血, HBsAg ELISA 檢測結(jié)果S/CO為0.5(法國伯樂)、0.44(上?？迫A)，抗-HCV ELISA 檢測結(jié)果S/CO為0.02(珠海麗珠)、0.07(北京萬泰)，說明此人獻血時正處于HCV ELISA檢測“窗口期”，這是本實驗室自2010年開展核酸檢測以來檢出的唯一1例HCV RNA反應(yīng)性而抗-HCV無反應(yīng)性的獻血者。

綜上所述, ELISA檢測無反應(yīng)性的樣本，進口試劑和國產(chǎn)試劑都會出現(xiàn)假陰性，而NAT 檢測可以縮短ELISA檢測的“窗口期”，有效降低經(jīng)輸血傳播疾病的風(fēng)險。