張翔　吳泱　董曉俊　張鴻振　王蕭楓　梅凌　張濤

[摘要] 目的 通過(guò)觀察激素性骨壞死模型造模前后骨代謝變化，闡述干預(yù)APN-AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨壞死的作用機(jī)制。 方法 共20只健康成年白兔，隨機(jī)分為正常組和造模組，每組10只，應(yīng)用LPS聯(lián)合醋酸潑尼松龍誘導(dǎo)激素性股骨頭壞死模型，療程為9周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄動(dòng)物一般情況，造模前后分別對(duì)所有兔耳緣靜脈取血2 mL，進(jìn)行ELISA檢測(cè);通過(guò)病理組織學(xué)檢查確定造模成功，同時(shí)分別進(jìn)行骨細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)、TNF-α/OPG相關(guān)性分析。 結(jié)果 造模后，造模組兔血漿APN水平（2.49±0.48）ng/mL，較同組造模前（6.74±0.04）ng/mL比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;造模組兔骨細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)為（0.364±0.017），較造模前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，血清APN含量和AMPK mRNA表達(dá)與OPG含量呈正相關(guān)性，與TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。 結(jié)論 脂聯(lián)素體內(nèi)含量可直接引起骨壞死疾病進(jìn)程，也許APN-AMPK信號(hào)通路在疾病轉(zhuǎn)歸過(guò)程中承擔(dān)重要角色，通過(guò)干預(yù)APN-AMPK信號(hào)通路正向傳導(dǎo)，可以為臨床治療激素性股骨頭壞死提供新的思路和方法。

[關(guān)鍵詞] 激素性股骨頭壞死;APN-AMPK信號(hào)通路;動(dòng)物模型;機(jī)制研究

[中圖分類號(hào)] R580 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）21-0035-05

Study on mechanism of APN-AMPK signal pathway regulating bone metabolism in steroid-induced femoral head necrosis

ZHANG Xiang1 ? WU Yang2 ? DONG Xiaojun3 ? ZHANG Hongzhen1 ? WANG Xiaofeng1 ? MEI Ling3 ? ZHANG Tao4

1.Department of TCM Orthopedics，Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Zhejiang Province， Wenzhou ? 325000， China; 2.Internal Medicine of TCM，Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine in Zhejiang Province， Wenzhou ? 325000， China; 3.Department of Orthopedics， Wuhan Hospital of ?Traditional Chinese Medicine， Wuhan ? 430014， China; 4. Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan ? 430014， China

[Abstract] Objective To expound the mechanism of regulating osteonecrosis by intervening APN-AMPK signal pathway through observing the changes of bone metabolism before and after the modeling of steroid-induced femoral head necrosis. Methods A total of 20 healthy adult rabbits were randomly divided into the normal group and the model group，with 10 rabbits in each group. LPS and prednisolone acetate were used to induce the steroid-induced femoral head necrosis. The course lasted for 9 weeks. During the experiment，the general conditions of the animals were recorded. Two ml of blood was taken from the ear veins of all rabbits before and after the modeling，and ELISA was performed. Histopathological examination was conducted to determine the success of the modeling. In the meantime， how the AMPK mRNA expression in the bone cells was correlated with the level of TNF-α and the level of OPG was also analyzed respectively. Results The plasma APN level of rabbits in the model group after modeling （2.49±0.48）ng/mL was significantly lower than that before modeling（6.74±0.04） ng/mL， the difference was statistically significant（P<0.05）. The AMPK mRNA expression in the rabbit bone cells in the model group after modeling（0.364±0.017）was significantly lower than that before modeling， the difference was statistically significant（P<0.05）. In addition，the serum APN content and AMPK mRNA expression were positively correlated with OPG content and negatively correlated with TNF-α expression. Conclusion The content level of adiponectin can directly trigger the progression of osteonecrosis. Perhaps the APN-AMPK signal pathway plays an important role in the process of disease progression. By intervening in the positive conduction of the APN-AMPK signal pathway， new ideas and methods can be generated for the clinical treatment of steroid-induced femoral head necrosis.

[Key words] Steroid-induced femoral head necrosis; APN-AMPK signal pathway; Animal model; Study on mechanism

股骨頭缺血性壞死（Avascular necrosis of femoral head，ANFH）是一種累及骨的漸進(jìn)破壞，最終導(dǎo)致軟骨下骨塌陷和髖關(guān)節(jié)損傷的疾病。這種疾病是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球健康問(wèn)題，美國(guó)每年確診ANFH患者2～3萬(wàn)例[1]，而中國(guó)15歲以上ANFH患者有812萬(wàn)[2-3]。激素性股骨頭壞死（SANFH）是ANFH中較為常見(jiàn)的一種類型，誘因源自于大量使用糖皮質(zhì)激素，國(guó)內(nèi)外研究顯示SANFH發(fā)病率已占該病種首位[4-5]，研究SANFH治療轉(zhuǎn)歸一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的焦點(diǎn)。AMPK被認(rèn)為是體內(nèi)的一類能量傳感器，可維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[6]，在機(jī)體中通過(guò)AMPK信號(hào)通路可干預(yù)細(xì)胞能量代謝，調(diào)節(jié)糖脂代謝，促進(jìn)能量代謝趨于平衡。通過(guò)改善體內(nèi)脂聯(lián)素（Adiponectin，APN）血漿濃度，促進(jìn)AMPK信號(hào)通路正向傳導(dǎo)，加強(qiáng)脂質(zhì)代謝，從而對(duì)血管內(nèi)皮起到保護(hù)和改善細(xì)胞凋亡作用[7-8]。因此，干預(yù)APN-AMPK信號(hào)通路在調(diào)控激素性股骨頭壞死轉(zhuǎn)歸過(guò)程中具有正向作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年新西蘭大耳白兔20只，每只體重（2.5±0.2）kg，雌雄各半，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)武漢市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行[9]，并由藥學(xué)實(shí)驗(yàn)基地提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SKXK（鄂）2010-0056]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

主要包括：TRIZOL 試劑盒（Invitrogen Company）;熒光定量PCR試劑盒（Bio-Rad 公司，批號(hào)1725201）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司）;兔腫瘤壞死因子免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;兔脂聯(lián)素（ADP）ELISA 試劑盒（上海亞培生物科技有限公司）;此外，40%甲醛溶液、10%水合氯醛溶液/中性樹(shù)脂封固劑等輔助試劑等均由武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)研究基地提供。

1.3 方法

1.3.1 造模方法 ?于2014年11月～2018年6月在武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)研究基地國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，由作者與導(dǎo)師董曉俊教授團(tuán)隊(duì)一同組織完成，采用內(nèi)毒素聯(lián)合糖皮質(zhì)激素法造模[10]。

1.3.2 分組方法 ?動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室采用恒溫系統(tǒng)，定時(shí)喂養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為正常組和造模組，每組10只。造模組采用內(nèi)毒素聯(lián)合激素造模方法：造模開(kāi)始第1天首先采用耳緣靜脈注射LPS（10 μg/kg，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)111M4035V），24 h后重復(fù)給藥;第2次注射LPS立即醋酸氫化潑尼松龍8 mg/kg（浙江仙琚制藥股份有限公司，125 mg/支，批號(hào)H33020824）臀肌注射，注射3周，停藥3周，繼續(xù)用藥3周。正常組與造模組在相同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。兩組動(dòng)物均單籠標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)，第9周末在正常組和造模組隨機(jī)抽取2只兔拍股骨頭正位片，觀察股骨頭囊性變區(qū)域和防止股骨頭塌陷。研究期間，所有動(dòng)物采用青霉素鈉8.0×105 U/kg肌注（哈藥集團(tuán)制藥總廠，80萬(wàn)U/支，批號(hào)A080700411），每周2次。

1.3.3 取材和組織學(xué)切片 ?血液樣本：造模前后經(jīng)耳緣靜脈對(duì)所有兔取血，離心取上層血清液保存。所有兔在實(shí)驗(yàn)第9周末處死，處死后迅速解剖出兔左側(cè)股骨，利用鋸條將兔股骨干分成數(shù)塊，每塊長(zhǎng)約1.5 mm，剔除骨外膜，用PBS將髓腔沖洗干凈，再用錫紙包裹骨組織。先將骨組織置于-75℃冰箱中12 h，再投入液氮中保存。將右側(cè)股骨頭沿冠狀面切開(kāi)，固定，脫鈣，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度4 μm，進(jìn)行HE染色在光鏡下觀察組織形態(tài)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 病理組織學(xué)檢查 ?光鏡下觀察組織學(xué)切片，觀察骨小梁鏡下變化，并進(jìn)行相關(guān)計(jì)數(shù)，同時(shí)對(duì)單位體積內(nèi)空骨陷窩率進(jìn)行測(cè)算。

1.4.2 兔脂聯(lián)素（APN）ELISA指標(biāo) ?造模前后分別對(duì)所有兔進(jìn)行耳緣靜脈采血2 mL，然后立即離心取上層血清液保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按照ELISA試劑盒（上海亞培生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)：收集兔耳緣靜脈取2 mL，血清：1000×g離心10 min將血清和紅細(xì)胞迅速小心分離。血漿：1000×g離心30 min去除顆粒。細(xì)胞上清液：1000×g離心10 min去除顆粒和聚合物。使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于反應(yīng)孔，加入待測(cè)樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。每孔加入80 μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10 min，避免光照，取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

1.4.3 股骨頭局部TNF-α/OPG免疫組化檢測(cè) ?將樣本、試劑和標(biāo)準(zhǔn)品加入37℃反應(yīng)30 min，隨后洗板5次;加入酶標(biāo)實(shí)際，37℃反應(yīng)30 min;再次洗板5次，加入顯色液，37℃顯色10 min，最后加入終止液，15 min之內(nèi)讀取OD 值，進(jìn)一步計(jì)算。

1.4.4 兔股骨頭骨細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá) ?將取材的兔股骨頭組織取出，向兔股骨頭組織中加入1 mL TRIZOL裂解液裂解細(xì)胞，按照invitrogen TRIZOL說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取：向兔股骨頭組織中加入1 mL TRIZOL裂解液裂解細(xì)胞，用移液槍反復(fù)輕柔吹打使細(xì)胞裂解。轉(zhuǎn)移細(xì)胞至1.5 mL EP管中加入氯仿0.2 mL，充分混勻，室溫孵育2 min，4℃低溫離心機(jī) 12 000 r/min離心10 min。棄去上清液后加入75%的乙醇1 mL，清洗沉淀，12 000 r/min下離心2 min。去除乙醇溶液，室溫下干燥沉淀物 5～10 min，加入去離子水，溶解沉淀。取3 μL細(xì)胞總RNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察，判定RNA完整性。取逆轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑，測(cè)量各RNA濃度，取普通八連管，加入體系：（1）5×primescript RT Enzyme MIX 2 μL/4 μL;（2）Total RNA 500 ng/1 μg（按體系計(jì)算體積）;（3）RNase Free ddH2O up to 10 μL/up to 20 μL于普通PCR儀上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ forever）。根據(jù)NCBI公布的AMPK基因序列分別設(shè)計(jì)AMPK-R作為q-PCR引物，內(nèi)部參照（內(nèi)參）基因?yàn)榧?dòng)蛋白（Actin），引物為ActR，引物序列見(jiàn)表1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);兩變量相關(guān)性以Pearson相關(guān)系數(shù)r表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組動(dòng)物一般觀察比較

造模第2天造模組兔即出現(xiàn)神志萎靡癥狀，第4周均出現(xiàn)食欲不振，體重明顯減輕，步態(tài)異常，活動(dòng)明顯減少，可見(jiàn)脫毛現(xiàn)象;至第9周末大部分兔子出現(xiàn)站立困難，跛行。正常組動(dòng)物未出現(xiàn)明顯異常，兩組兔均無(wú)脫失。

2.2 兩組動(dòng)物血漿APN水平比較

造模前分別對(duì)兩組兔血漿APN水平進(jìn)行檢測(cè)，造模前兩組血漿APN水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模后，正常組兔血漿APN水平（6.41±0.36）ng/mL，較同組造模前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模組兔血漿APN水平（2.49±0.48）ng/mL，較同組造模前比較水平明顯降低，且明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明糖皮質(zhì)激素可影響兔血漿APN水平，從而引起骨壞死，見(jiàn)表2。

2.3 兩組動(dòng)物病理組織學(xué)檢查比較[11]

造模組HE染色切片和組織形態(tài)學(xué)觀察顯示骨小梁減少，密度降低，局部骨小梁連續(xù)性中斷。骨細(xì)胞核固縮，空骨陷窩明顯增多。骨髓腔內(nèi)有新出血區(qū)，骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多，骨壞死顯著，正常組未見(jiàn)明顯異常，見(jiàn)封三圖2～3。造模組空骨陷窩率較對(duì)照組明顯升高，說(shuō)明股骨頭骨組織破壞較大（P<0.01），見(jiàn)表3。根據(jù)早期激素性股骨頭壞死的病理學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，可確定兔早期激素性股骨頭壞死模型成功建立。

2.4 兩組動(dòng)物X線檢查結(jié)果比較

造模完成后，隨機(jī)在正常組和造模組中抽取2只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行X線片檢查，造模組可見(jiàn)股骨頭密度不均勻，骨小梁模糊，正常組未見(jiàn)明顯異常，說(shuō)明造模成功，見(jiàn)圖1。

2.5 兩組動(dòng)物股骨頭骨細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)比較

造模前，所有兔骨細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)明顯差異（P>0.05）;實(shí)驗(yàn)9周末，造模組兔骨細(xì)胞AMPK mRNA表達(dá)為（0.364±0.017），較造模前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明激素性骨壞死可導(dǎo)致兔股骨頭骨細(xì)胞中AMPK mRNA表達(dá)明顯減少，見(jiàn)圖2。

2.6 造模組造模前后TNF-α/OPG 免疫組化IOD值比較

造模前后分別對(duì)造模組進(jìn)行TNF-α/OPG免疫組化檢測(cè)，造模后兔股骨頭壞死區(qū)域內(nèi)TNF-α炎性因子表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，IOD值較造模前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)，造模后壞死區(qū)域內(nèi)OPG表達(dá)降低，IOD值較造模前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

2.7 造模組APN-AMPK信號(hào)通路與TNF-α/OPG相關(guān)性分析

分析APN-AMPK信號(hào)通路與TNF-α/OPG相關(guān)性，可見(jiàn)血清APN含量和AMPK mRNA表達(dá)與OPG含量呈正相關(guān)性，與TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，見(jiàn)表5。

3 討論

脂肪組織是一種特殊的能量?jī)?chǔ)存器官，分泌促炎細(xì)胞因子，合成多種脂肪因子，調(diào)節(jié)其他組織的生理功能[14]。在這些脂肪因子中，脂聯(lián)素（APN）又稱Acrp30、apM1和adipoQ，最初被認(rèn)為是一種脂肪特異性蛋白，主要是由分化的脂肪細(xì)胞分泌。隨著現(xiàn)代研究的深入，APN已成為脂肪細(xì)胞最豐富的生化產(chǎn)物，具有影響能量平衡、干預(yù)胰島素敏感性、血管粥樣硬化轉(zhuǎn)歸和改變炎癥反應(yīng)等作用。以往研究顯示，APN是能量消耗和代謝的調(diào)節(jié)因子，但是最近觀點(diǎn)認(rèn)為APN可參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程[15-16]，已有學(xué)者指出APN可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的成骨及骨缺損的修復(fù)[17];也有學(xué)者通過(guò)應(yīng)用APN干預(yù)大鼠腦缺血再灌注損傷模型，可有效改善損傷進(jìn)程[18]。眾所周知，激素性股骨頭缺血性壞死誘因源自于大量使用糖皮質(zhì)激素，導(dǎo)致股骨頭脂質(zhì)代謝異常，以及血管結(jié)構(gòu)和功能破壞。已有研究證實(shí)刺激APN基因adipoq表達(dá)，可調(diào)節(jié)股骨頭局部血管重建[19-20]。除此之外，APN能夠通過(guò)減少糖異生而減少甘油三酯的積累[21]，對(duì)激素性股骨頭壞死的結(jié)構(gòu)重建起到重要作用。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，APN在激素性股骨頭壞死血管重建和結(jié)構(gòu)改善進(jìn)程中承擔(dān)了重要角色，通過(guò)干預(yù)體內(nèi)APN水平或許能夠?yàn)橹委熂に匦怨晒穷^壞死提供新的方法。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一個(gè)異源三聚體蛋白，普遍存在于真核生物中，由催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β和γ三個(gè)亞基組成[22]。能被AMP與ATP 的比值變化所把控，廣泛參與機(jī)體內(nèi)代謝和能量需要[23]。研究顯示，AMPK的α亞基在骨骼肌、心肌和肝臟中廣泛表達(dá)，可以通過(guò)增強(qiáng)骨骼肌對(duì)糖脂類的攝取，干預(yù)脂肪組織和葡萄糖的轉(zhuǎn)化，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

通過(guò)本次研究，能夠驗(yàn)證APN是AMPK的激活劑之一[24]，造模組動(dòng)物造模后血漿APN濃度明顯降低，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素能夠降低APN含量，進(jìn)而作用于AMPK信號(hào)通路負(fù)向傳導(dǎo)，減低脂質(zhì)代謝。此外，通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)，骨壞死兔模型中AMPK mRNA表達(dá)明顯較造模前降低，同時(shí)TNF-α/OPG免疫組化指標(biāo)也相應(yīng)的出現(xiàn)波動(dòng)，因此在激素性股骨頭壞死模型構(gòu)建過(guò)程中，由于糖皮質(zhì)激素堆積引起AMPK酶活性降低，降低AMPK信號(hào)通路正向傳導(dǎo)，加劇骨壞死的形成。以往研究表明AMPK的激活會(huì)引起成骨細(xì)胞的分化和礦化[25-26]，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的骨修復(fù)過(guò)程，本次研究能夠證實(shí)通過(guò)干預(yù)APN-AMPK信號(hào)通路也許是治療激素性股骨頭壞死的潛在方法。

綜上，脂聯(lián)素體內(nèi)含量可直接引起骨壞死疾病進(jìn)程，也許APN-AMPK信號(hào)通路在疾病轉(zhuǎn)歸過(guò)程中承擔(dān)重要角色，如果通過(guò)干預(yù)體內(nèi)APN含量，誘導(dǎo)APN-AMPK信號(hào)通路正向傳導(dǎo)，能夠有效降低股骨頭壞死區(qū)域炎癥反應(yīng)，降低血脂，進(jìn)而保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)骨組織結(jié)構(gòu)修復(fù)，這可能成為治療激素性股骨頭壞死的新的思路和方法。

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（收稿日期：2019-09-10）