周 紅，娜日罕，榮 鈺，董 莉（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,呼和浩特 010050）

擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy, DCM）是以左心室或者雙心室擴(kuò)大伴收縮功能障礙為特征的心肌病。目前，DCM 的診斷缺乏特異度和靈敏度，易造成誤診、漏診。因此，早期診斷、及時(shí)治療對本病尤為重要。新發(fā)現(xiàn)的一種微小RNA（miRNA），可控制各種細(xì)胞的功能，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，調(diào)控多種心臟疾病的病理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 可穩(wěn)定存在于血液循環(huán)中。目前研究較多的是miRNA-126 和miRNA-30a。其中，miRNA-126（也稱為內(nèi)皮特異性miRNA-126）在血管生成中起著重要作用，被認(rèn)為是血管損傷和內(nèi)皮功能障礙的預(yù)后生物標(biāo)志物[2]?？梢酝ㄟ^抑制炎癥期間的血管細(xì)胞黏附分子-1 蛋白水平來防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[3]。miRNA-30的過度表達(dá)降低了胱硫醚-C-裂合酶（CSE）的表達(dá)和硫化氫（H2S）的產(chǎn)生，進(jìn)而加重了缺氧誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞損傷[4]。但是對于miRNA-126，miRNA-30 與DCM 的相關(guān)研究報(bào)道尚少，我們通過測定40 例患者不同治療方法前后miRNA-126 和miRNA-30a 含量的變化，分析其與其它臨床資料的相關(guān)性，探討其是否可作為DCM的診斷、療效指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)收集2014.2 ～ 2019.3 就診于我院心內(nèi)科首診為DCM（根據(jù)2007年《心肌病診斷與治療建議》）且心功能IV 級（根據(jù)NYHA 分級）的患者，男性23 例，女性17 例，年齡55±13歲。收集同期來我院體檢中心的健康體檢者20 例為對照組，男性10 例，女性10 例，年齡53±10 歲。所有入組對象均簽署知情同意書。本實(shí)驗(yàn)已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。對40 例患者均進(jìn)行β-受體阻劑、利尿劑、醛固酮受體拮抗劑，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素受體拮抗劑（ARB)等常規(guī)一般治療[5]。隨后按患者在常規(guī)一般治療的基礎(chǔ)上是否自愿接受自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療（由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科醫(yī)生完成操作），分為一般治療組20 例，手術(shù)治療組20 例。進(jìn)行歷時(shí)1年的規(guī)律治療，1年后收集兩組患者血清。

1.2 儀器及試劑 miRcute 血清miRNA 提取分離試劑盒，PCR 試劑盒均采用天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。引物序列為miRNA-126：CAUUAUUACUUUUGGUACGCG；miRNA-30a：UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集：患者組和對照組均采集空腹血3ml，在4h 內(nèi)進(jìn)行離心（3 000r/min，10min），取血清置于-80℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 miRNA 表達(dá)量檢測：采用qRT-PCR 法檢測血清中miRNA-126，miRNA-30a 的相對含量，使用 2-△△Ct值來表示基因表達(dá)的相對量。△Ct =Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)差）或中位數(shù)（四分位間距）表示。各組間比較使用ann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)。偏態(tài)分布數(shù)據(jù)相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

由于各種原因?qū)е码S訪病人失訪，最終一般治療組14 例、手術(shù)治療組12 例完成1年隨訪工作。對研究對象的年齡、性別、家族史、高血壓、糖尿病等一般基本情況進(jìn)行分析，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；射血分?jǐn)?shù)、NT-proBNP 及心胸比等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1 循 環(huán)miRNA-126，miRNA-30a 在DCM 患 者兩種方法治療后療效的判斷 見表1，表2。手術(shù)組治療前后兩種miRNA 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Z = -3.059，P=0.002），一般治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -1.538，P=0.124；Z = -1.726，P=0.084）。說明自體細(xì)胞移植加一般治療療效較單純一般治療影響較大。

表1 兩種方法治療前后miRNA 表達(dá)量的比較

2.2 相關(guān)性分析 循環(huán)miRNA-126 與NT-proBNP呈負(fù)相關(guān)（r = - 0.355，P=0.013）。循環(huán)miRNA-30a與NT-proBNP 呈正相關(guān)（r = 0.306，P =0.034），與射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（r = - 0.333 ,P =0.019）。

2.3 DCM 患者miRNA12 個(gè)月預(yù)后 COX 回歸分析 見表3。對DCM 患者12 個(gè)月預(yù)后進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-126 的12 個(gè)月相對危險(xiǎn)度為 0.768（95% CI 0.431～1.37，P ＝0.372），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； miRNA-30a 的12 個(gè)月生存分析其相對危險(xiǎn)度 為1.141（95% CI 0.775～1.678 ，P ＝0.504），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 患者miRNA 12 個(gè)月預(yù)后 COX 回歸分析

3 討論

DCM 病因多樣，可能因感染、中毒、內(nèi)分泌紊亂、遺傳等因素。其中，RNA 家族中的小核糖核酸病毒直接侵襲和由此引發(fā)的慢性炎癥和免疫反應(yīng)是造成心肌損害的機(jī)制；有研究證明DCM 患者具有內(nèi)皮功能障礙，其特征是內(nèi)皮祖細(xì)胞集落形成單位減少（EPC-CFUS）并降低了血流介導(dǎo)的血管舒張（FMD）[6]。而骨髓來源的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCS）具有抗纖維化、促進(jìn)血管生成和免疫調(diào)節(jié)的特性，可促進(jìn)受損組織的修復(fù)。就此，我們通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，研究是否可以增加內(nèi)皮祖細(xì)胞集落形成單位，從而達(dá)到在源頭上改變內(nèi)皮功能，最終修復(fù)心肌損傷。這也是本實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

首先，miRNA-126 是抗凋亡內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控基因：①血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中BCL-2 的表達(dá)，而miRNA-126 可以在多種組織中調(diào)節(jié)VEGF 的表達(dá)。因此，miRNA-126可能是調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞BCL-2 和VEGF 表達(dá)的合適候選分子，過表達(dá)miRNA-126 可能通過下調(diào)BCL-2 和VEGF 來降低抗凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞[7]。②miRNA-126 抑制調(diào)節(jié)單位，通過RAS/ERK 和PI3K/AKT 途徑調(diào)節(jié)（VEGFR-2）相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在血管生成中起重要作用：具體為通過調(diào)節(jié)上述途徑的信號來增強(qiáng)VEGFR-2 下游的血管生成信號[8]。③miRNA-126 在基因水平調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與新生血管的形成過程中，還會(huì)通過激活PI3K / Akt /eNOS 信號通路增強(qiáng)了間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（MSCEX）對缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷的內(nèi)皮細(xì)胞（EC）增殖，遷移和血管形成的有益作用，并且更有效地抑制了H/R 誘導(dǎo)的與下調(diào)caspase-3 相關(guān)的EC 凋亡。④miRNA-126 進(jìn)一步促進(jìn)了MSC-EXs 在提高受H/ R 損傷的EC 中細(xì)胞生長因子（FGF，bFGF）和血管生成因子（PDGF，VEGF）水平方面的作用[9]。

miRNA-30a 來源于miRNA-30 家族，其家族調(diào)控一種與纖維化有關(guān)的關(guān)鍵分子-結(jié)締組織生長因子（CTGF）[10]。在體外實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)過表達(dá)或抑制這些小RNA 可以通過直接與CTGF mRNA 的3′UTR 區(qū)相互作用有效抑制CTGF 的表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)心肌纖維化。①miRNA-30a 與心臟關(guān)系密切（已有研究表明）[11]，可能有利于鑒定AMI。②根據(jù)YUAN 等人[12]的研究結(jié)果，miRNA-30a 抑制心肌成纖維細(xì)胞中snail 1 的表達(dá)，進(jìn)而通過一些未知的機(jī)制導(dǎo)致骨膜蛋白表達(dá)下調(diào)。③miRNA-30a 的過度表達(dá)導(dǎo)致snail 1 蛋白表達(dá)下調(diào)，這是由于miRNA -30a 增強(qiáng)了snail1 蛋白的翻譯抑制作用，從而使snail1 蛋白表達(dá)水平的降低導(dǎo)致骨膜蛋白的去除和纖維化的發(fā)生。④miRNA-30a 具有抗凋亡作用，其在細(xì)胞自噬中發(fā)揮作用，自噬在缺血時(shí)保護(hù)心肌細(xì)胞，而在再灌注過程中是有害的。Beclin-1 蛋白是細(xì)胞自噬的重要標(biāo)志。HUANG等[13]人的研究結(jié)果表明miRNA-30a 在血管緊張素II（Ang Ⅱ）損傷過程中通過調(diào)節(jié)Beclin-1 蛋白發(fā)揮重要作用，因此通過調(diào)節(jié)miRNA-30a 的表達(dá)將自噬控制在一個(gè)有益的閾值以下成為可能，以保護(hù)心肌細(xì)胞免受Ang Ⅱ的損傷。由此，我們聯(lián)合檢測miRNA-30a 與miRNA-126，通過對不同方法治療前后的變化情況分析其對疾病治療的意義。

DCM 的治療大多使用內(nèi)科一般藥物治療方法，這些一般都試圖降低心肌損傷的發(fā)生率，但是缺乏再生潛能。自體細(xì)胞移植可以有效地從根本上改變心肌損傷。①骨髓來源的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCS）具有抗纖維化、促進(jìn)血管生成和免疫調(diào)節(jié)的特性，可促進(jìn)受損組織的修復(fù)。②MSCS 改善DCM 患者心功能的機(jī)制包括內(nèi)皮功能的恢復(fù)，內(nèi)皮功能可促進(jìn)冠脈循環(huán)[6,14]。③可能通過分泌心臟保護(hù)因子發(fā)揮旁分泌作用。這些分泌因子可能刺激血管生長和重塑，減弱纖維化，調(diào)節(jié)炎癥，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和存活，并招募常駐干細(xì)胞或祖細(xì)胞[15]。從而產(chǎn)生新的細(xì)胞，具有再生能力，從根本上治療DCM。通過兩種治療方法后miRNA-30a 和miRNA-126 表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)自體細(xì)胞移植組較單純內(nèi)科一般藥物治療組治療DCM 患者影響更大，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但因入組的人數(shù)較少，樣本量小，缺乏普遍性，有待于繼續(xù)擴(kuò)大病例量。

DCM 患 者miRNA-126 和miRNA-30a 與正常對照組比較無顯著性差異，不能作為DCM（NYHA分級IV 級）的診斷指標(biāo)?？赡芘c文獻(xiàn)報(bào)道[16]DCM與BAG3（B 細(xì)胞淋巴瘤2 相關(guān)的致癌基因3）中的錯(cuò)義變體有關(guān)。是否由于DCM 病因的多樣性與基因的錯(cuò)義變體相關(guān)，導(dǎo)致miRNA 生成受到影響，從而無法準(zhǔn)確測量其真實(shí)表達(dá)量，我們尚且不能得出結(jié)論。但就目標(biāo)基因與DCM 乃至于心衰診斷指標(biāo)的相關(guān)性方面，我們發(fā)現(xiàn)，miRNA-126 與NT-proBNP 呈 負(fù)相關(guān)，miRNA-30a 與NT-proBNP呈正相關(guān)，miRNA-30a 與LVEF 呈負(fù)相關(guān)。其中，miRNA-126 與NT-proBNP 呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果與WEI等[3]人做的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，因此可以嘗試聯(lián)合診斷。

我們分析了miRNA-126 和miRNA-30a 是否與DCM（心功能IV 期）患者預(yù)后相關(guān)，在評估預(yù)后的方面是否有著一定的臨床價(jià)值。對DCM 患者12個(gè)月預(yù)后進(jìn)行生存分析，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可知miRNA-126 和miRNA-30a 并非DCM（心功能IV 期）患者1年內(nèi)發(fā)生主要不良心臟事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。

綜上所述，miRNA-30a 和miRNA-126 檢測可用于DCM 病人療效觀察，并可能為其提供有效的基因?qū)W依據(jù)。