柴春艷,王 甜,劉婭萍,徐邦強,趙 媛,李雅莉

（1.陜西省人民醫(yī)院西院一病區(qū)，西安710068；2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，西安 710004）

近年來，肺癌的發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢,有研究證實隨著體重指數(shù)升高，肺癌發(fā)生率、死亡率顯著增高。瘦素（Leptin）是人類1994年發(fā)現(xiàn)的由肥胖基因編碼的多功能肽類激素，傳遞肥胖信號到大腦,參與動物繁殖、造血和血管生成等重要生理過程[1]。Leptin 參與調(diào)節(jié)能量代謝，在調(diào)控飲食、平衡機體能量等過程中發(fā)揮重要作用，和惡性腫瘤導致的營養(yǎng)不良存在顯著的聯(lián)系，可作為評估腫瘤患者整體狀況和預后的一個新指標[2]。有研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，Leptin 是一種新的促腫瘤生長因子，能激活腫瘤細胞的分化增殖,增強腫瘤細胞的侵襲力。本研究通過檢測肺癌患者血清及肺癌組織中Leptin 的表達，證實Leptin 在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及臨床意義，為肺癌的早期診斷、基因靶向治療、預后評估提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取陜西省人民醫(yī)院支氣管肺癌標本118 例，均為2012～2019年手術切除并經(jīng)病理證實的標本，24 例癌旁正常肺組織。男性支氣管肺癌患者60 例，女性支氣管肺癌患者58 例。依據(jù)WHO 肺癌的分型標準進行組織學分類：鱗癌43例，腺癌45 例，小細胞肺癌30 例。依據(jù)2015年國際肺癌研究學會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）標準分期：I 期28 例，Ⅱ期30 例，Ⅲ期32 例，Ⅳ期28 例。有肺門和(或)縱隔淋巴結轉移及遠處轉移(簡稱轉移) 70 例，無淋巴結轉移48 例。

1.2 儀器與試劑 血清Leptin 應用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，采用Phoenix Pharmaceuticals Ine 試劑盒；免疫組化SP 法采用鼠抗人Leptin 單克隆抗體及SP 染色試劑盒均購于西安騰智醫(yī)學診斷試劑有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 所有病例均禁食12h 后，抽取清晨空腹靜脈血5ml，分離血清-20℃保存待測。血清標本在檢測前室溫復融,為消除批間差異，實驗為一次性完成。血清Leptin 嚴格按試劑盒說明進行操作。

1.3.2 支氣管肺癌組織中Leptin 的表達 采用免疫組化SP 法檢測，用已知陽性切片作陽性對照，PBS 代替一抗作陰性對照。

1.3.3 結果判定 在肺癌組織中，Leptin 主要表達在腫瘤細胞的胞漿中，出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒判定為陽性細胞，每張切片連續(xù)觀察，選取5個高倍視野，在每個高倍視野計數(shù)1 000 個癌細胞，觀察陽性細胞染色強度，計數(shù)陽性細胞百分數(shù)。由2 位病理科醫(yī)師采用雙盲法判定陽性細胞和陰性細胞。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,采用Pearson χ2檢驗、Fisher’s 精確檢驗、成組配對t 檢驗比較不同臨床特征、病理類型等的免疫組化陽性比例。P＜0.05 判定為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Leptin 在肺癌患者血清中的表達 見表1。Leptin 在肺癌組患者血清中的濃度為3.6±1.5μg/L,明顯高于對照組(1.6±0.7μg/L)，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.485，P=0.002)，兩組營養(yǎng)狀況參數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 兩組血清Leptin 及營養(yǎng)狀況參數(shù)的比較(±s)

表1 兩組血清Leptin 及營養(yǎng)狀況參數(shù)的比較(±s)

項目 對照組 肺癌組 t P瘦素（μg/L） 1.6±0.7 3.6±1.5 3.485 0.002體重指數(shù)（Kg/m2） 20.1±2.8 18.3±1.5 0.853 0.400 ALB(g/L) 40.0±2.2 38.6±2.1 0.686 0.500 TSF (mm) 9.5±1.6 7.3±1.5 1.321 0.200

2.2 Leptin 在肺癌組織中的表達

2.2.1 Leptin 表達陽性率 Leptin 表達主要位于腫瘤細胞的胞漿中，陽性產(chǎn)物呈棕黃色彌漫分布。在118 例肺癌患者中Leptin 的表達陽性率為75.42%（89/118），在癌旁正常肺組織Leptin 表達陽性率為25.00%（6/24），兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2.2 Leptin 蛋白表達與支氣管肺癌一般臨床特征的關系 見表2。Leptin 在60 例男性患者中陽性表達率為95.00%（57/60），在58 例女性患者中陽性表達率為55.17%（32/58），兩者相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=25.237，P ＜0.05)。提示支氣管肺癌患者性別對Leptin 蛋白表達的影響具有統(tǒng)計學意義，產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能與吸煙指數(shù)有關，本研究證實Leptin 在吸煙指數(shù)≥400 的患者中高表達，可作為Leptin 與其他理化因素協(xié)同致癌的有力證據(jù)。隨著肺癌患者分化程度的降低，Leptin 蛋白表達陽性率隨之升高，差異有統(tǒng)計學意義，I+II 期與III+IV期肺癌患者中Leptin 表達陽性率比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。在有淋巴結轉移的肺癌患者中Leptin 蛋白表達陽性率高于無淋巴結轉移的患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.831，P=0.002）。本研究證實Leptin 表達與支氣管肺癌患者分化程度、臨床分期、有無淋巴結轉移密切相關，可作為評估肺癌預后的指標。研究證實Leptin 蛋白表達與支氣管肺癌患者的年齡、病理類型無明顯關系，差異無統(tǒng)計學意義。

表2 Leptin 蛋白表達與支氣管肺癌臨床基本特征及病理、TMN 分期間的關系

圖1 Leptin 在腺癌中陽性表達SP×200

圖2 Leptin 蛋白在小細胞癌陽性表達SP×400

3 討論

Leptin[5]是含146 個氨基酸的肽類激素，由位于7q31.3 的肥胖基因編碼。瘦素作為一種肽類激素，它的生物學效應是由瘦素受體介導的。Leptin mRNA 作為細胞因子，在下丘腦、肺、肝臟、腎臟、卵巢、胎盤、骨骼肌等組織中表達。Leptin 反映的靶器官是胎兒和成人肺組織，Leptin 參與促進胎兒肺發(fā)育和成熟，并維持肺功能處于穩(wěn)態(tài)，在成人肺泡細胞的生理性和病理性增殖中發(fā)揮作用[6]。Leptin-LepR 系統(tǒng)作為內(nèi)分泌腺可以促進良、惡性腫瘤上皮細胞內(nèi)的血管生成，體外實驗發(fā)現(xiàn)[7]，Leptin 受體在動物和人細胞系中的高表達促使腫瘤細胞增殖。越來越多的研究證明Leptin-LepR 系統(tǒng)參與了肺癌的發(fā)生、進展和免疫應答過程。

Leptin 誘導肺癌細胞抵抗凋亡的機制：①Leptin通過抑制CCAAT/增強子結合蛋白的激活，降低了磷酸化的蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase,PERK）和活化轉錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）的信號通路活性，從而阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所介導的凋亡，激活腫瘤細胞增殖[8]。②肺癌患者體內(nèi)Leptin-LepR 系統(tǒng)激活后，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)表達上調(diào),或直接作用于血管內(nèi)皮細胞，肺癌患者的血管內(nèi)皮細胞增殖和血管的重塑被激活，肺癌的浸潤和轉移增加[9]。③促分裂素原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）Akt/mTOR 等信號通路的活化進一步促進Leptin 表達[10]。有研究證實[11]，Akt，mTOR 等磷酸化在肺癌組織中表達明顯增高，血管內(nèi)皮生長因子、Akt 和mTOR 基因的mRNA 表達水平在肺癌組織中也較癌旁肺組織明顯升高，在肺癌組織中Leptin 特異性高表達的特性，在腫瘤的基因診斷及靶向治療中具有潛在的應用價值[12]。本實驗結果顯示，在肺癌組織中Leptin 表達陽性率顯著高于癌旁組織，也進一步印證了這一觀點。

本研究證實肺癌患者血清Leptin 明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示肺癌患者體內(nèi)存在顯著的能量消耗、脂肪分解。這與WERYNSKA 等[13]研究結果一致，認為腫瘤患者出現(xiàn)食欲減退、惡病質(zhì)等消耗癥狀與多種炎性細胞因子誘導Leptin 生成增加有關, 即“細胞因子-瘦素”學說。但陶曉南等[14]研究結果卻顯示肺癌患者組的血清Leptin 水平低于對照組，造成研究結果不一致的原因可能是入組患者臨床資料差異性，及晚期肺癌患者處于惡病質(zhì)狀態(tài)后的Leptin 水平調(diào)節(jié)突破了正常的生理范圍，肺癌并發(fā)惡病質(zhì)的患者體內(nèi)Leptin 水平調(diào)節(jié)具體機制尚需進一步研究探索。

支氣管肺癌患者臨床病理參數(shù)與Leptin 表達之間的關系目前仍存在爭議，本研究顯示支氣管肺癌患者的年齡、病理類型與Leptin 表達無關，性別與Leptin 表達顯著相關。肺癌患者的分化程度、臨床分期、有無淋巴結轉移與 Leptin 表達有關，這與馮和林[15]等的研究結論一致，說明Leptin參與了肺癌的進展過程，可以作為評價肺癌預后的指標之一。

本研究結果證實，支氣管肺癌患者伴有淋巴結轉移Leptin 表達率明顯高于無淋巴結轉移者，說明淋巴結作為局部免疫器官，在支氣管肺癌的轉移中發(fā)揮了重要作用。Leptin 表達在重度吸煙患者中明顯高于不吸煙或少量吸煙者，提示Leptin 可能是吸煙致癌的重要分子標志之一，而長期密切接觸煙草可能是啟動Leptin 高表達的重要物理因素之一，這在國內(nèi)研究領域尚未涉及。

支氣管肺癌的早期癥狀大多不典型，放化療的臨床效果差，因此早期診斷及治療一直是個難題，考慮到“Leptin-Leptin 受體系統(tǒng)”在肺癌發(fā)生、進展均發(fā)揮重要作用，煙草等外界理化因素可能導致其過表達而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可以為腫瘤的早期診斷和治療提供新思路和新途徑。目前Leptin-LepR 系統(tǒng)在腫瘤局部微環(huán)境中發(fā)揮作用的機制尚未完全闡明，進一步探討肺癌患者Leptin 表達對腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)的機制，有利于發(fā)現(xiàn)并逆轉腫瘤細胞免疫逃逸，發(fā)現(xiàn)殺傷腫瘤細胞更高效的治療方法。