張?chǎng)魏?，張濤元，?俏，祝擷英，曹三成，吳 爽

（1.日照心臟病醫(yī)院，山東日照 276800；2.西安交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,西安 710003）

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的癌癥之一，在消化系統(tǒng)腫瘤中，死亡率占第 3 位，且與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，肝癌在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率和死亡率更高[1]。已有證據(jù)顯示，包括cyclin D1(CCND1)[1]，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、c-myc 在內(nèi)的基因異常表達(dá)以及Ras 基因[3]、腫瘤抑制基因的突變表達(dá)參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而，由于早期缺乏有效的診斷方法，在疾病的發(fā)展階段，肝癌的死亡率仍然很高。因此，揭示肝癌致癌、癌癥轉(zhuǎn)移及肝癌復(fù)發(fā)等分子機(jī)制，對(duì)研發(fā)有效的診斷和治療方法而言，是十分重要且迫切的。

在過(guò)去的幾十年里，微陣列技術(shù)和生物信息技術(shù)已被廣泛用于鑒定基因組表達(dá)水平的改變[4]，幫助我們識(shí)別肝癌相關(guān)的差異表達(dá)基因和相關(guān)信號(hào)通路。然而單一芯片分析的假陽(yáng)性率較高，難以獲得可靠的結(jié)果。本研究從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)GEO 中下載三個(gè)芯片微陣列數(shù)據(jù)集，從而獲得更可靠的正常肝組織與肝癌組織之間的差異表達(dá)基因，探究更多與肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)化相關(guān)的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料 利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)GEO[5]，在GPL570 檢測(cè)平臺(tái)下，檢索三組人源性肝細(xì)胞肝癌的基因芯片，芯片信息為Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，編號(hào)分別為GSE88839[6]（肝癌組織3 例、正常肝組織35 例）、GSE101685[7]（肝癌組織8 例、正常肝組織324 例）、GSE112790[8]（肝癌組織15 例、正常肝組織3183例）。

1.2 方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1.2.1 差異表達(dá)基因的篩選：利用在線分析工具GEO2R 對(duì)三組芯片的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，當(dāng)LogFC(foldchange)＞1.5，P＜0.05 時(shí)，基因表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用韋恩對(duì)三組差異基因取交集，獲得共同差異表達(dá)基因。

1.2.2 差異表達(dá)基因的富集分析：將差異表達(dá)基因載入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)[9]進(jìn)行富集分析，以人源基因?yàn)楸尘斑M(jìn)行生物學(xué)功能注釋及KEGG 信號(hào)通路的富集。P＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵模塊的基因分析：利用STRING[10]數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，用Cytoscape[11]軟件可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用MCODE 插件，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中蛋白作用關(guān)系，確定核心基因。MCODE 設(shè)置如下：MCODE scores＞5, degree cut-off=2, node score cut-off=0.2, Max depth=100 and k-score=2。利用UCSC[12]癌基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心基因繪制層次聚類熱圖。

1.2.4 關(guān)鍵基因的臨床數(shù)據(jù)分析：利用 Kaplan Meier-Plotter(http://kmplot.com/analysis/)網(wǎng)站，分析核心基因?qū)Ω伟┗颊呖偵媛实挠绊?。根?jù)核心基因表達(dá)值的中位數(shù)，將肝癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組兩組，計(jì)算危險(xiǎn)比(HR)、 95%置信區(qū)間及P 值，并繪制生存曲線。利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析關(guān)鍵基因的mRNA 表達(dá)情況與肝癌患者的癌癥分期和腫瘤分級(jí)之間的相關(guān)性，T 檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，且P ＜0.05 時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因 見(jiàn)圖1。將三組芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理后獲得共同差異基因74 個(gè)，其中GSE88839 共有差異基因301 個(gè)，GSE101685共有差異基因1189 個(gè)，GSE112790 共有差異基因1109 個(gè)。

圖1 肝癌差異表達(dá)基因的韋恩圖

2.2 GO 富集分析 見(jiàn)表1。GO 富集結(jié)果表明：上述74 個(gè)差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外小體、氧化還原等生物過(guò)程。

2.3 KEGG Pathway 富集分析見(jiàn)表2。KEGG Pathway 富集分析顯示：差異基因主要參與代謝途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53 信號(hào)通路及氨基酸合成等相關(guān)通路。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選 去除游離的蛋白后，共得到了由 70 個(gè)點(diǎn)，213 條邊構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖 2A。用Cytoscape 軟件的MCODE 插件，獲取由15 個(gè)點(diǎn)，102 條邊構(gòu)成的相互作用程度最高的核心基因PPI 網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2B，15 個(gè)點(diǎn)的基因名分別為：ECT2, DTL, PBK, TOP2A, CDKN3,NCAPG, ANLN, HMMR, RRM2, RACGAP1,KIF20A, BUB1B, CCNA2, TYMS, ZWINT。UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這15 個(gè)核心基因進(jìn)行層次聚類，發(fā)現(xiàn)這15 個(gè)基因在正常肝組織中低表達(dá)，在大部分肝癌組織中高表達(dá)，見(jiàn)圖2C。

2.5 預(yù)后價(jià)值分析 見(jiàn)圖3。利用Kaplan Meier-Plotter 對(duì)15 個(gè)核心差異表達(dá)基因與肝癌患者的預(yù)后進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：ANLN（HR=2.14，95%CI:1.49～3.08，P=2.6E-05）,ECT2（HR=2.09，95%CI:1.48～2.97，P=2.3E-05）,HMMR（HR=2.29，95%CI:1.62～3.34，P=1.3E-06）,KIF20A（HR=2.33，95%CI:1.63～3.32，P=1.8E-06）,NCAPG（HR=2.19，95%CI:1.54～3.13，P=8.8E-06）,PBK（HR=2.24，95%CI:1.5～3.34，P=4.8E-05）,RACGAP1（HR=2.24，95%CI:1.44～3.5，P=2.7E-04）,ZWINT（HR=2.36，95%CI:1.66～3.35，P=8.5E-07）的高表達(dá)與肝癌患者較差的總生存率存在相關(guān)性。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩

表1 肝癌差異基因的GO 富集分析

表2 肝癌差異基因的KEGG Pathway 富集分析

圖3 ANLN, ECT2, HMMR, KIF20A, NCAPG, PBK, RACGAP1, ZWINT 在肝癌中的預(yù)后價(jià)值

2.6 核心差異表達(dá)基因與肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 見(jiàn)圖4。分析上述8 個(gè)基因與肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示與正常肝組織相比， ECT2, KIF20A, PBK, RACGAP1 和ZWINT 的mRNA 水平在不同的肝癌分級(jí)、分期中明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

肝癌是世界第五大惡性腫瘤，其發(fā)病率在近年來(lái)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[13]。肝癌的主要病因包括慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、黃曲霉毒素中毒及與之相關(guān)的基因突變、細(xì)胞損傷等[2]。細(xì)胞周期蛋白D1(CCND 1), c-myc 或ras 的突變、cyclind 2(CCDN 2)啟動(dòng)子的高度甲基化以及p53 或p21 的異常表達(dá)已被證實(shí)與肝癌有關(guān)[14-15]。由于這些基因?qū)Ω伟┰缙谠\斷并不適用，因此迫切需要發(fā)現(xiàn)新肝癌診斷和治療的生物標(biāo)志物。

本文以生物信息學(xué)分析方法為基礎(chǔ)，利用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的三組肝癌芯片數(shù)據(jù)，共篩選出79個(gè)與正常肝組織具有表達(dá)差異的肝癌基因。 GO 和KEGG 富集分析顯示，差異表達(dá)基因與細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外小體、氧化還原、代謝途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53 信號(hào)通路及氨基酸合成等生物過(guò)程密切相關(guān)，提示肝癌組織中，細(xì)胞異常增殖，且細(xì)胞凋亡失?！，F(xiàn)已證實(shí)[16]p53 通路參與了肝癌的發(fā)生，抑癌基因p53 與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及細(xì)胞凋亡的調(diào)控密切相關(guān)。 因此p53 信號(hào)通路異常，可促使肝癌細(xì)胞惡性增殖、抑制凋亡。同時(shí)本文中差異基因所聚焦的氧化還原、代謝途徑等生物過(guò)程與肝癌患者的肝功能紊亂癥狀一致。對(duì)本研究共發(fā)現(xiàn)與8 個(gè)基因與肝癌患者總生存率相關(guān)，5 個(gè)基因與肝癌患者的臨床病理相關(guān)，對(duì)這些基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘，證實(shí)這些基因與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及其預(yù)后關(guān)系密切。ECT2 在肝再生過(guò)程中以細(xì)胞周期依賴的方式表達(dá)，并被認(rèn)為在調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂中起著重要作用。有文獻(xiàn)表明ECT2 的表達(dá)可能是包括乳腺癌、肺癌在內(nèi)的多種癌癥發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一，且ECT 2 的高表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)預(yù)后不良的獨(dú)立因素[17]。KIF20A 是胞質(zhì)分裂的重要調(diào)節(jié)因子，已有大量隊(duì)列研究表明，KIF20A 在肝癌組織中的異常表達(dá)，與其較差的總生存率密切相關(guān)[18]。PDZ 結(jié)合激酶(PBK)的大量表達(dá)常與肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)，PBK 能通過(guò)ETV 4-uPAR 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移，有望成為肝癌轉(zhuǎn)移的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[18]。RABGAP 家族蛋白通過(guò)使RAB 蛋白失活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，如細(xì)胞骨架重塑、囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞遷移等[20]，RACGAP 1 與TPR 協(xié)同作用，通過(guò)降低Hippo 和YAP 通路的激活和促進(jìn)胞質(zhì)分裂，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[21]。ZWINT 在有絲分裂檢查點(diǎn)中起著重要作用，可以保證染色體在子代細(xì)胞間平均分配。據(jù)報(bào)道，ZWINT 與包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌等在內(nèi)的十幾種癌癥密切相關(guān)，且ZWINT是肝癌術(shù)后患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[22]。

綜上，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析了肝細(xì)胞肝癌的基因芯片數(shù)據(jù)。希望能夠深入了解肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為肝癌的臨床檢測(cè)、治療提供新的潛在生物標(biāo)志物。但是，由于缺乏有效的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)這些基因在肝癌組織中的功能進(jìn)行分析驗(yàn)證，因此本研究是局限的。盡管如此，本研究仍有助于更深入地了解肝癌的分子機(jī)制，并指導(dǎo)后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。