王超男，李偉皓，沈?qū)毱G，李江雪，張 佳，劉曉梅，張菲菲，張智萍，馮曉燕，張賀秋

（1.東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院特檢科，石家莊 050000；3.蒙城縣第一人民醫(yī)院腎病免疫風(fēng)濕科，安徽亳州233500）

膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）是一種器官特異性自身免疫疾病，是導(dǎo)致成人腎病綜合征的常見病因[1-3]。根據(jù)病因?qū)⒛ば阅I病分為兩類，第一類為沒有明確病因的“原發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）”，約占總患病人數(shù)的70%。第二類為由乙型肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、癌癥和藥物不良反應(yīng)等引起的“繼發(fā)性膜性腎?。╯econdary membranous nephropathy，SMN）”，約占總患病人數(shù)的30%[4]。IMN 和SMN 的臨床表現(xiàn)和組織學(xué)表現(xiàn)相同，但治療方法完全不同[5-6]，IMN 的治療更為復(fù)雜，包括多種治療方案，所以針對(duì)IMN 的正確鑒別診斷尤為重要。

目前臨床上IMN 的診斷主要包括兩類方法，一類是侵入性診斷方法，如腎臟穿刺、組織學(xué)檢查或腎組織電鏡檢查等，但侵入性方法為有創(chuàng)性操作，會(huì)對(duì)患者造成一定程度上的傷害，風(fēng)險(xiǎn)高，可能會(huì)引起一系列并發(fā)癥，并且不適于動(dòng)態(tài)觀察患者病情。2009年，BECK 等[7-8]首次發(fā)現(xiàn)了膜性腎病的靶抗原-M 型磷脂酶A2 受體（phospholipase A2 receptor,PLA2R），表明PLA2R 是IMN 的一個(gè)主要自身抗原。隨之出現(xiàn)了另一類非侵入性的PLA2R 自身抗體血清學(xué)診斷方法[9-10]，不僅快速、簡(jiǎn)便易行，而且可以動(dòng)態(tài)觀察病情，指導(dǎo)治療[11]，主要包括細(xì)胞免疫熒光方法（immunofluorescence assay，IFA）和酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。但ELISA 方法由于存在與抗人IgG 的非特異反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽(yáng)性。而IFA 方法不但具有血清學(xué)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，還能夠直觀觀察熒光的細(xì)胞分布，提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性，被譽(yù)為自身抗體血清學(xué)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

但是目前對(duì)于PLA2R 自身抗體的檢測(cè)只有德國(guó)歐蒙公司的進(jìn)口試劑，且價(jià)格昂貴。因此，本研究目的在于構(gòu)建表達(dá)PLA2R 蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株，并對(duì)其在膜性腎病診斷中的應(yīng)用進(jìn)行探索，以期能夠?yàn)閷?shí)現(xiàn)PLA2R 自身抗體檢測(cè)試劑的國(guó)產(chǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院和蒙城縣第一人民醫(yī)院2018 ～2019年就診并進(jìn)行抗PLA2R 抗體檢測(cè)的腎病患者血清共97 例，患者年齡16 ～74 歲，平均年齡48.2±15.9 歲，男性61 例，女性36 例。根據(jù)歐蒙抗PLA2R 抗體IgG 檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法），當(dāng)血清抗PLA2R 抗體＜14 RU/ml 時(shí)，則認(rèn)為血清呈抗PLA2R 抗體陰性，當(dāng)血清抗PLA2R 抗體≥14 RU/ml 時(shí)，則認(rèn)為血清呈抗PLA2R 抗體陽(yáng)性。陰性組55 例，男性32 例，女性23 例，平均年齡48±16.2 歲；陽(yáng)性組42 例，男性27 例，女性15 例，平均年齡48±15.9 歲。血清無脂血、溶血等不合格情況，收集于干燥潔凈EP 管，?80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 pIRES-PLA2R 質(zhì)粒（北京中美泰和公司）；質(zhì)粒抽提純化試劑盒（QIAGEN 公司）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermofisher公司）；CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢腦細(xì)胞，Chinese Hamsters Ovary）細(xì)胞（ATCC）；抗生素G-418（Sigma公司）；通用總蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海生工公司）；總RNA 提取試劑盒（上海生工公司）；RTPCR 試劑盒SuperScript ? One-Step RT-PCR System（Thermofisher 公司）；兔抗PLA2R 多抗（Atlas公司） ；FITC-羊抗兔IgG抗體（北京中杉金橋公司）；FITC-羊抗人IgG 抗體（北京中杉金橋公司）。

1.3 方法

1.3.1 PLA2R 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：綜合生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)報(bào)道，從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)取PLA2R的全長(zhǎng)編碼基因（NM_007366.4）。由于PLA2R全長(zhǎng)編碼基因的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，為避免在基因調(diào)取和擴(kuò)增過程中產(chǎn)生基因突變，委托北京中美泰和公司進(jìn)行基因合成并將全長(zhǎng)基因連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pIRESneo 中，構(gòu)建pIRES-PLA2R 質(zhì)粒。用質(zhì)粒純化試劑盒抽提pIRES-PLA2R 質(zhì)粒并瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.2 PLA2R 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建：pIRESPLA2R 質(zhì)粒定量后用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前一天將CHO 細(xì)胞以3×105個(gè)/ 孔的密度接種于6 孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜。按照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別用PLA2R 真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-PLA2R、空質(zhì)粒pIRESneo 和不含質(zhì)粒的PBS 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后更換為含1mg/ml G-418 的完全培養(yǎng)液，每隔3 天更換新鮮培養(yǎng)液。

1.3.3 PLA2R 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的鑒定：待CHOPLA2R 組、CHO-Control 組正常生長(zhǎng)且PBS 對(duì)照組細(xì)胞全部死亡時(shí)，收取CHO-PLA2R 組和CHOControl 組的部分細(xì)胞進(jìn)行RT-RCR，Western 免疫印跡和IFA 鑒定。

1.3.3.1 RT-RCR 鑒 定：用 總RNA提取試劑盒提取CHO-PLA2R 組 和CHO-Control 組細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 鑒定。根據(jù)PLA2R 全長(zhǎng)基因，設(shè)計(jì)合成RT-PCR 鑒定引物F1（序列：TCGTTTCCTTACGGTGGCCGCT）和R1（序列：TTCTGCAGAGGTGGGATCAG）。 根 據(jù)RT-PCR試劑盒說明書，取4μl RNA 提取物作為擴(kuò)增模板，F(xiàn)1/R1 作為引物對(duì)，按試劑盒要求進(jìn)行一步法RTPCR，50℃ 30 min 逆轉(zhuǎn)錄，95℃ 15 min 預(yù)變性后，進(jìn)行PCR 循環(huán)：95℃ 45 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，循環(huán)40 次，72℃延伸5 min。取PCR 產(chǎn)物5 μl 進(jìn)行1g/dl 瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.3.2 Western 免疫印跡鑒定：用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取CHO-PLA2R 組和CHO-Control 組的細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行Western 免疫印跡鑒定。取總蛋白80μg 進(jìn)行8g/dl SDS-PAGE，然后電轉(zhuǎn)印于PVDF膜。封閉后加入1:1 000 稀釋的抗PLA2R 抗體，4℃孵育過夜。洗膜后加入1:500 稀釋的FITC-羊抗兔IgG，室溫孵育1 h。洗膜后ECL 顯色。

1.3.3.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定：在IFA 方法鑒定前一天將經(jīng)G-418 篩選的CHO-PLA2R 細(xì)胞和CHOControl 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，37℃培養(yǎng)過夜，PBS 洗1 次，每次5 min。用4ml/dl 多聚甲醛固定，PBS 洗3 次。PBS 洗后加入1∶100 稀釋的FITC-兔抗PLA2R 抗體，濕盒室溫孵育2h，PBS 洗3 次。加入1∶400 稀釋的FITC-羊抗兔IgG，濕盒室溫孵育30min，PBS 洗3 次。防熒光淬滅劑封片，置熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對(duì)照。

1.3.4 PLA2R 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的細(xì)胞免疫熒光方法的初步評(píng)價(jià)：用CHO-PLA2R 細(xì)胞作為基質(zhì)對(duì)97例腎病患者血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。在IFA 方法檢測(cè)前一天將CHO-PLA2R 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，37℃培養(yǎng)過夜，PBS 洗1 次，每次5min。4ml/dl 多聚甲醛固定15 min。PBS 洗后加入1∶50 稀釋的血清樣本，濕盒室溫孵育2 h。PBS洗后加入1∶300 稀釋的FITC-羊抗人IgG，濕盒室溫孵育30 min。PBS 洗后加入防熒光淬滅劑封片，置熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Kappa 檢驗(yàn)對(duì)兩種方法的評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)P 值和Kappa 值進(jìn)行分析。如果P＜0.05，則具有一定的一致性。Kappa值＜0.2 則說明一致性程度較差；0.2～0.4 則說明一致性程度一般；0.4～0.6 則說明一致性程度中等；0.6～0.8 則說明一致性程度較強(qiáng)；0.8～1.0 則說明一致性程度很強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 PLA2R 真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 北京中美泰和公司完成基因合成和pIRES-PLA2R 質(zhì)粒構(gòu)建，并提供測(cè)序報(bào)告證明PLA2R 基因序列完全正確。

抽提pIRES-PLA2R 質(zhì)粒。根據(jù)pIRESneo 質(zhì)粒說明書，pIRESneo 質(zhì)粒分子量大小應(yīng)為5.3kb，合成的全長(zhǎng)編碼基因大小為4 389bp，因此pIRESPLA2R 質(zhì)粒的分子量大小約為9.8kb。瓊脂糖凝膠電泳顯示pIRES-PLA2R 質(zhì)粒分子量大小與預(yù)期分子量大小一致，見圖1。成功抽提供細(xì)胞轉(zhuǎn)染的PLA2R 真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-PLA2R，質(zhì)粒濃度為0.48 μg/μl。

2.2 PLA2R 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-PLA2R 的鑒定分別以PLA2R 真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-PLA2R 和空質(zhì)粒pIRESneo 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，經(jīng)G-418 篩選后獲得表達(dá)PLA2R 的穩(wěn)定細(xì)胞株CHO-PLA2R 和對(duì)照細(xì)胞株CHO-Control，鑒定結(jié)果見圖1。

2.2.1 RT-PCR鑒定提取CHO-PLA2R 組 和CHOControl 組細(xì)胞的總RNA：以鑒定引物F1/R1 進(jìn)行一步法RT-PCR。結(jié)果顯示CHO-PLA2R 組在350bp處出現(xiàn)一條唯一條帶，而CHO-Control 組細(xì)胞未見擴(kuò)增條帶，見圖2。與預(yù)期結(jié)果相符，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CHO-PLA2R 能夠正常轉(zhuǎn)錄PLA2R 基因。

圖2 細(xì)胞總RNA RT-PCR 鑒定

2.2.2 Western 免疫印跡鑒定提取CHO-PLA2R 組和CHO-Control 組細(xì)胞的總蛋白：以PLA2R 兔多抗為一抗進(jìn)行Western 免疫印跡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示CHO-PLA2R 組在約180kD 處有明顯條帶，與PLA2R 蛋白的預(yù)期分子量相符，而CHO-Control組未見相應(yīng)條帶，見圖3。表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株CHO-PLA2R 可以穩(wěn)定表達(dá)PLA2R 蛋白。

圖3 細(xì)胞總蛋白Western 免疫印跡鑒定

2.2.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定：以抗PLA2R 抗體為一抗進(jìn)行IFA 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，CHO-PLA2R 細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)部分呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，而CHO-Control細(xì)胞則幾乎無熒光（見圖4）。表明成功構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株CHO-PLA2R，可以高水平表達(dá)PLA2R 蛋白。

圖4 CHO-PLA2R 細(xì)胞IFA 方法鑒定

2.3 PLA2R 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-PLA2R 的初步應(yīng)用 用篩選出的CHO-PLA2R 細(xì)胞對(duì)97 例臨床腎病患者樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表1。PLA2R自身抗體的ELISA 檢測(cè)結(jié)果為陰性55 例，陽(yáng)性42例。55 例ELISA 檢測(cè)陰性（＜14 RU/ml）樣本中，CHO-PLA2R 細(xì)胞IFA 方法檢測(cè)結(jié)果均為陰性見圖5，特異性符合率100%（55/55）。ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性（≥14 RU/ml）樣本共42 例，其中陽(yáng)性高值（≥100 RU/ml））樣本26 例，陽(yáng)性低值（14 ～99 RU/ml）樣本16 例。ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性樣本中，IFA方法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性32 例（見圖5），陰性10 例，符合率76.2%（32/42）。其中，ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性高值26 例樣本中，IFA 方法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性24 例，陰性2 例，符合率92.3%（24/26）；ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性低值16 例樣本中，IFA 方法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性8 例，陰性8 例，符合率50%（8/16）。97 例腎病患者血清樣本兩種檢測(cè)方法的總符合率為89.7%（87/97）。

表1 97 例腎病患者血清樣本抗PLA2R 抗體ELISA 方法與IFA 方法結(jié)果對(duì)比

圖5 血清樣本IFA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用Kappa 檢驗(yàn)對(duì)兩種方法評(píng)價(jià)結(jié)果的一致性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ELISA 結(jié)果陽(yáng)性樣本和ELISA 結(jié)果陰性樣本均具有一定的一致性（均P＜0.05），其中ELISA 結(jié)果陽(yáng)性樣本一致性程度中等（Kappa=0.456），ELISA 結(jié)果陰性樣本一致性很強(qiáng)（Kappa=1.0）。

3 討論

慢性腎病被稱為“沉默的殺手”，很多患者早期沒有癥狀，其中約30%～50%的患者將發(fā)展為終末期腎病，對(duì)患者的身心健康造成極大影響[1-2]。我國(guó)的MN 發(fā)病幾率逐年上升，從2005年到2017年，MN 在我國(guó)的腎活檢病人中發(fā)病率由9.1%增長(zhǎng)到26.5%[9]。MN 可根據(jù)病因分為原發(fā)性膜性腎病和繼發(fā)性膜性腎病，其中IMN 的發(fā)病率在我國(guó)已達(dá)到70%～80%[4]。IMN 和SMN 的臨床表現(xiàn)十分相近，但治療方法卻完全不同，因此正確鑒別IMN在臨床診斷和治療工作中具有十分重要的意義。目前，MN 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是腎穿刺活檢術(shù)，但其為有創(chuàng)性操作，不便于病情的動(dòng)態(tài)觀察，也不能鑒別IMN 與SMN。

PLA2R 是I 型跨膜蛋白，屬于C 型外源性凝集素家族[12-13]。2009年，BECK 研究團(tuán)隊(duì)在70%的IMN 患者體內(nèi)檢出PLA2R，提示PLA2R 可能參與了IMN 發(fā)病過程。隨后，HOXHA 等[14]人發(fā)現(xiàn)IMN 患者體內(nèi)抗PLA2R 抗體的陽(yáng)性率高達(dá)81%。日本一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，IMN 患者體內(nèi)抗PLA2R抗體的陽(yáng)性率為53%[15]。近期國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，IMN 患者體內(nèi)抗PLA2R 抗體的陽(yáng)性率為57%[16]，另一項(xiàng)研究中陽(yáng)性率高達(dá)85.4%[17]。以上研究提示抗PLA2R 自身抗體可能是導(dǎo)致IMN 的致病抗體。多個(gè)研究表明，抗PLA2R 抗體診斷IMN 的靈敏度可達(dá)70%～85%，特異度更是高達(dá)99%[18-20]。因此，抗PLA2R 抗體作為一種病原標(biāo)志物極具診斷意義。此外，針對(duì)PLA2R 自身抗體開發(fā)的血清學(xué)檢測(cè)不僅快速、簡(jiǎn)便易行，還可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病情活動(dòng)，為IMN 的治療和預(yù)后提供參考。因此，本文構(gòu)建了表達(dá)PLA2R 的穩(wěn)定細(xì)胞株，以期提供一種高效的IMN 體外診斷工具。

本文首先構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-PLA2R。用pIRES-PLA2R 質(zhì)粒對(duì)CHO 細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，RT-PCR 實(shí)驗(yàn)、Western 免疫印跡實(shí)驗(yàn)和IFA 實(shí)驗(yàn)分別從分子、蛋白和細(xì)胞水平證明成功構(gòu)建表達(dá)PLA2R 蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株CHO-PLA2R。

將所構(gòu)建的細(xì)胞株應(yīng)用于抗PLA2R 抗體的IFA 方法體外診斷，與ELISA 方法相比，陰性樣本的符合率為100%（55/55）；陽(yáng)性樣本的總符合率為76.2%（32/42），其中陽(yáng)性高值樣本的符合率為92.3%（24/26），陽(yáng)性低值樣本的符合率為50%（8/16）；樣本的總體符合率為89.7%（87/97）。使用Kappa 檢驗(yàn)分析兩種方法的一致性，ELISA 陽(yáng)性樣本和ELISA 陰性樣本均具有一定的一致性，其中ELISA 陽(yáng)性樣本的一致性程度中等，也就是對(duì)陽(yáng)性樣本檢測(cè)的符合率較低；ELISA 陰性樣本結(jié)果一致性強(qiáng)，也就是對(duì)陰性樣本檢測(cè)的符合率高。ELISA 陽(yáng)性樣本結(jié)果一致性不強(qiáng)主要是由于弱陽(yáng)性樣本的符合率不高（50%，8/16）。

部分ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性樣本在本實(shí)驗(yàn)中使用IFA方法未能成功檢出，分析原因可能是作為對(duì)照的ELISA 方法由于酶聯(lián)板的非特異吸附、二抗的非特異性結(jié)合、血清中的其他自身抗體引起的非特異反應(yīng)大大增加了假陽(yáng)性率，使得ELISA 方法弱陽(yáng)性結(jié)果的準(zhǔn)確性降低。而IFA 方法是檢測(cè)自身抗體的經(jīng)典方法。理論上，只要胞膜或胞漿中存在相應(yīng)的抗原，就可特異性檢測(cè)對(duì)應(yīng)抗體，因此，根據(jù)是否存在熒光可以檢測(cè)是否存在相應(yīng)的自身抗體（圖5A，5B）。另一方面，根據(jù)熒光的分布特點(diǎn)及其與對(duì)照細(xì)胞的熒光比較可以排除非特異熒光結(jié)果，從而能夠減少假陽(yáng)性，提高準(zhǔn)確性，減少誤診。例如在本文的方法中，有些樣本檢測(cè)時(shí)整個(gè)細(xì)胞均呈現(xiàn)熒光，或者在細(xì)胞核而非細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)熒光，還有些樣本的熒光分布與CHO-Control 對(duì)照細(xì)胞完全相同，即可判定為非特異性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基于CHO-PLA2R 細(xì)胞株建立的IFA 檢測(cè)方法具有很高的特異性，為IMN 的深入研究及體外診斷提供了有力的生物學(xué)工具。但是，該方法對(duì)ELISA檢測(cè)灰區(qū)附近的弱陽(yáng)性樣本無法明確判斷，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果。我們將對(duì)IFA 方法進(jìn)一步改進(jìn)，以提高靈敏度。另外，與ELISA 方法相比，IFA 方法無法進(jìn)行精確定量檢測(cè)，不能用于IMN 患者的療效評(píng)估，在臨床上需要與ELISA 方法聯(lián)合使用。