練家惠，陳向東，汪 輝，陳全順

中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)教研室，南京210009

隨著抗生素的廣泛使用，抗生素濫用現(xiàn)象逐漸增多，耐藥菌的種類和數(shù)量也越來越多，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)，因此，迫切的需要新型抗菌藥物的研發(fā)來解決這一難題?？咕模ˋMPs）是機體（動物、植物或微生物）在外界刺激誘導(dǎo)下，由特定基因編碼、合成的一類具有廣譜抗菌活性的陽離子多肽，是機體非特異性宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分[1]。通過對AMPs 構(gòu)效關(guān)系和作用機理的深入研究，結(jié)合生物信息學(xué)對天然抗菌肽進(jìn)行定向優(yōu)化或者從頭設(shè)計，有望設(shè)計出抗菌活性強、溶血性低、更優(yōu)藥代動力學(xué)的AMPs。

Temporin-1Dra（HFLGTLVNLAKKIL-NH2）是一種從美國加利福尼亞紅腿蛙Rana draytonii 皮膚分泌物中提取分離出來的抗菌肽，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌具有較好的抑菌作用，但其較強的溶血性限制了臨床使用[2]。

本文主要對Temporin-1Dra 進(jìn)行氨基酸替換，對改造之后的多肽序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期獲得低毒性、對白色念珠耐藥菌株具有抑菌活性的AMPs，為解決臨床抗生素耐藥的新型抗菌藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 受試菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：白色念珠菌（Canidia albicans ATCC 98001）、耐氟康唑（FLC）白色念珠菌均由中國藥科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。10 株Canidia albicans耐藥菌株，來自南方醫(yī)院臨床檢驗室所分離。

1.2 藥品和試劑

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 委托常州康龍生物科技有限公司采用化學(xué)固相合成法而得，純度（HPLC）>95%；氟康唑（FLC，南京森貝伽生物科技有限公司）；Mueller-Hinton 瓊脂、肉湯培養(yǎng)基、Sabouraud Dextrose 瓊脂、肉湯培養(yǎng)基（北京三藥科技有限公司）。

1.3 儀器設(shè)備

KD20001A 電子天平（南京凱德計量儀表有限公司）；GHX-9080B 恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；96 孔板 （Thermo Fisher Scientific 公司）；高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司）；潔凈工作臺（吳江市凈化設(shè)備總廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

2 方 法

2.1 多肽的生物信息學(xué)分析

抗菌肽的抑菌活性受其所帶電荷數(shù)的影響，有文獻(xiàn)報道，抗菌肽magainin 2 的電荷數(shù)從+3 增加到+5 時，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的抑菌活性有所提高，若繼續(xù)增加正電荷數(shù)則會使其溶血性增加而抑菌活性卻沒有提高[3]。氨基酸的螺旋程度影響著抗菌肽的體內(nèi)穩(wěn)定性，人體可識別并且降解天然的L 型氨基酸，用D 型氨基酸對L 型氨基酸進(jìn)行替換可以保護(hù)抗菌肽免受體內(nèi)蛋白酶的識別和降解。研究表明，將天然抗菌肽 Temporin -1Dra（HFLGTLVNLAKKIL-NH2）第4、5、8 位的氨基酸分別用D 型K（賴氨酸）替換，改造之后的三條多肽序列均顯示出對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株有明顯抑菌活性，且溶血性有所降低[2]，但對耐藥菌株無作用。加之抗菌肽對細(xì)菌和真菌的抑菌機制大致相同，均可通過與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜相互作用發(fā)揮抑菌作用，因此對天然抗菌肽Temporin-1Dra（HFLGTLVNLAKKIL-NH2）進(jìn)行了如下改造：將其4、5、8 位的氨基酸同時用D-賴氨酸進(jìn)行替換，得到含有5 個正電荷的多肽序列：[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra（HFLKKLVKLAKKIL-NH2）。

運用生物信息學(xué)分析軟件CAMPR3、Prot-Param、SOPMA 分別對多肽序列[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的抗菌肽形成概率預(yù)測，理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[4，5]。

2.2 合成多肽溶血性測定

將無菌脫纖維羊血1000 g 離心5 min，取沉淀以pH 7.4 的磷酸緩沖液（PBS）洗滌3 次，再用PBS將其紅細(xì)胞濃度調(diào)整為1%；用生理鹽水將合成多肽濃度調(diào)整為512、256、128、64、32、16、8、4 μg·mL-1，加入等體積的紅細(xì)胞懸液，以PBS 為陰性對照組，以1% TritonX-100 為陽性對照。37 ℃作用1 h，1000 g 離心5 min，將上清液依次加入96 孔板，酶標(biāo)儀測定吸光度A540nm值。每個濃度設(shè)置3 個平行。

溶血率 （%）=（A540nm樣品-A540nm陰性）/（A540nm陽性-A540nm陰性）×100%。當(dāng)溶血率＞5%，認(rèn)為有細(xì)胞毒性。

2.3 藥敏實驗

采用CLSI 規(guī)定的微量肉湯稀釋法體外測定多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 對Canidia albicans標(biāo)準(zhǔn)菌株、耐氟康唑白色念珠菌以及臨床分離Canidia albicans 耐藥菌株的MIC 值。

肉湯微量稀釋法對合成多肽和菌懸液進(jìn)行稀釋，在96 孔板內(nèi)合成多肽，最終濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg·mL-1，無菌SD 肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照，菌懸液作為陽性對照。于96 孔板37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，肉眼未見渾濁，孔中所對應(yīng)的藥物最低濃度即為最小抑菌濃度（MIC）值。從未變混濁的孔中吸取培養(yǎng)物100 μL，均勻涂布到SD 瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，平板計數(shù)，按照最低殺菌濃度（MBC）規(guī)定：當(dāng)平板中菌落數(shù)≤5 時，藥物濃度最低的即為MBC 值。

2.4 時間-殺菌曲線測定

采用菌落計數(shù)法測定合成多肽對耐FLC 白色念珠菌在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24 h 的時間-殺菌曲線，多肽的濃度分別為2MIC、MIC、1/2MIC，同時設(shè)置FLC 對照組（濃度為MIC），空白生長對照組。

2.5 合成多肽與FLC 的聯(lián)合藥敏試驗

采用肉湯微量稀釋法進(jìn)行合成多肽和FLC 對耐FLC 白色念珠菌的聯(lián)合藥敏實驗。選取7×7 棋盤，合成多肽和FLC 藥液濃度梯度制備和菌懸液制備，且藥液濃度的最高濃度設(shè)定為各自最小抑菌值的兩倍（2MIC），然后倍比稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛取?6 孔板1-7依次為終濃度是32、16、8、4、2、1 μg·mL-1的FLC，AG 依次為終濃度是256、128、64、32、16、8、4 μg·mL-1的Linear-KL，每孔Linear-KL 和FLC 共計100 μL，然后加入100 μL 的菌懸液，同時設(shè)置含有200 μL 菌懸液的陽性對照組及含有200 μL SD 肉湯培養(yǎng)基的陰性對照組。然后用手輕敲96 孔板，使之混合均勻，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)18～24 h。

部分抑菌濃度指數(shù) （fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)IC index）是抗菌藥藥效學(xué)參數(shù)之一，F(xiàn)IC index=MIC（A）/MICA+MIC（B）/MICB，其中MIC（A）和MIC（B）分別代表A 藥和B 藥聯(lián)合用藥時各自的MIC 值，MICA 和MICB 分別代表A 藥和B 藥單獨用藥時的MIC 值。當(dāng)FIC index≤0.5 時，藥物A 和B 之間有協(xié)同抗菌作用;當(dāng)0.5＜FIC index≤1.0 時，藥物A 和B 聯(lián)合用藥的抑菌效果為相加作用；當(dāng)1.0＜FIC index≤2.0 時，藥物A 和B 聯(lián)合用藥的抑菌效果為無關(guān)作用；當(dāng)FIC index＞2.0 時，藥物A 和B 之間有拮抗作用，且2 種藥物聯(lián)合使用的效果顯著低于其中一種藥物單獨使用的效果。

3 結(jié)果

3.1 多肽生物信息學(xué)分析結(jié)果

氨基酸替換后的多肽序列：[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra（HFLKKLVKLAKKIL-NH2）。

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的抗菌肽形成概率預(yù)測、理化性質(zhì)分析、二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果分別如表1、表2、圖1 所示。

由表1 可知，多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra的抗菌肽形成概率相對較高，理論證明其具有抗菌活性的可能性很大；由表2 可知，該條多肽為含有14個氨基酸、5 個正電荷的陽離子短肽，除此之外不穩(wěn)定系數(shù)為-10.68，表明此多肽為穩(wěn)定蛋白。由圖1 可知，其二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋（6 個氨基酸殘基參與），占42.86%；延伸鏈（2 個氨基酸殘基參與），占14.29%；無規(guī)則卷曲（6 個氨基酸殘基參與），占42.86%。

表1 合成多肽的抗菌肽形成概率

表2 合成多肽的理化性質(zhì)分析結(jié)果

圖1 合成多肽的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.2 合成多肽溶血性測定

合成多肽溶血性測定結(jié)果如表3 所示。從表3中可以看出，溶血率隨著濃度的升高逐漸升高，多肽在128 μg·mL-1（MIC）范圍內(nèi)溶血率＜5%，即使在高于MIC 值2～4 倍時，溶血率仍然低于10%，有輕微的溶血現(xiàn)象。

表3 合成多肽的溶血性測定

3.3 藥敏實驗

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的體外藥敏實驗結(jié)果如表4 所示。

表4 合成多肽的抑菌活性測定（MIC，μg·mL-1）

由表4 可知，合成多肽對Canidia albicans ATCC 98001 的MIC 值為64 μg·mL-1，對Canidia albicans耐藥菌株的MIC 值在64～128 μg·mL-1；對耐FLC 白色念珠菌的MIC 值和MBC 值均為128μg·mL-1。

3.4 時間-殺菌曲線繪制

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 對耐氟康唑白色念珠菌的時間-殺菌曲線如圖2 所示。

圖2 [G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 時間-殺菌曲線

由圖2 可知，在0～3 h 內(nèi)，在2MIC、MIC、1/2MIC 濃度下多肽對耐藥菌株具有明顯的抑制作用，且隨濃度的增加殺菌效率逐漸增強。在MIC 濃度下，[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的殺菌速率強于氟康唑?qū)φ战M。

3.5 多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 與FLC 的聯(lián)合藥敏試驗

多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 和耐FLC 白色念珠菌的聯(lián)合抑菌結(jié)果如表5 所示。

表5 合成多肽和FLC 的聯(lián)合抑菌結(jié)果（MIC，μg·mL-1）

由表5 可知，聯(lián)合用藥時合成多肽和FLC 的MIC 分別為16 μg·mL-1、4 μg·mL-1，根據(jù)公式：FIC index=MIC（A）/MICA+MIC（B）/MICB。

部分抑菌濃度指數(shù) （FIC index）=0.375，F(xiàn)IC 指數(shù)≤0.5，即多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 和FLC之間有協(xié)同抗菌作用。

4 討論

以天然抗菌肽Temporin-1Dra 為模板，將其第4、5、8 位的氨基酸同時用D 型氨基酸進(jìn)行替換，得到含有5 個正電荷的陽離子多肽序列：[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra （（HFLKKLVKLAKKIL-NH2）。對改造之后的天然抗菌肽進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其抗菌肽形成概率相對較高；溶血性測定表明，其在128 μg·mL-1（MIC）范圍內(nèi)溶血率＜5%，無細(xì)胞毒性；體外抑菌活性檢測結(jié)果表明，對白色念珠菌耐藥菌株的MIC 值在64～128 μg·mL-1，故成功設(shè)計出一條溶血性低且對白色念珠菌耐藥菌株有抑制作用的抗菌肽。

在全球范圍內(nèi)，念珠菌每年造成4000 萬例感染病癥，白色念珠菌是其主要的感染病原體，所占念珠菌感染病的50%～70%。白色念珠菌是一種存在于人類皮膚、黏膜以及腸道中的條件致病真菌，可導(dǎo)致機體淺表和深部的白色念珠菌病乃至菌血癥[6]。唑類藥物氟康唑（FLC）可通過口服或靜脈給藥，用來治療口腔、皮膚、陰道等淺表皮膚念珠菌感染，但隨其廣泛使用，F(xiàn)LC 耐藥菌株不斷增加[7]。從[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 對耐FLC 白色念珠菌的殺菌曲線可以看出，多肽在3 h 內(nèi)、MIC 濃度下具有顯著的殺菌效率，且效果優(yōu)于FLC 對照組；與FLC 的聯(lián)合藥敏實驗結(jié)果表明，兩者聯(lián)合具有協(xié)同殺菌作用，可明顯降低對耐FLC 白色念珠菌的MIC值。推測抗菌肽可通過靜電相互作用與真菌細(xì)胞膜相結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物外漏，接下來可對[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的抑菌機制進(jìn)行深入的探究。

抗生素耐藥嚴(yán)重威脅著人類的健康，多肽[G4、T5、N8K]Temporin-1Dra 的設(shè)計和研究，為開發(fā)出針對臨床白色念珠菌耐藥菌株的新型抗菌藥物提供了又一參考。