杭 娟，金 麗，張心悅，卜 瑩，張曉丹

無錫聯(lián)勤保障中心藥品儀器監(jiān)督檢驗站，南京210002

順勢康膠囊為海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院研制的非標準復(fù)方制劑，處方由黨參、黃芪、麻黃等9味中藥組成，具有補中益氣、健脾斂肺、升陽舉陷的功效，臨床上用于治療變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻炎、分泌性中耳炎及慢性外耳道炎等[1]。黃芪、麻黃和甘草依次為此配方中的君藥、臣藥與佐藥。黃芪甲苷為黃芪的主要有效成分，常作為含黃芪制劑的質(zhì)量標準的指標。原質(zhì)量標準未對黃芪有效成分的含量進行控制，為進一步加強順勢康膠囊的質(zhì)量控制，本研究優(yōu)化了薄層色譜法鑒別黃芪、甘草以及麻黃，同時新增HPLC-ELSD 法測定黃芪甲苷的含量，對順勢康膠囊有效地進行質(zhì)量控制。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent1100 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；SEDEX75 型蒸發(fā)光散射檢測器（上海譜質(zhì)分析檢測技術(shù)有限公司）；MS105 電子天平、AL104 電子天平（均為Mettler Toledo 公司）；YOKO-ZS 紫外線分析攝影儀（武漢藥科新技術(shù)開始公司）。

1.2 藥品與試劑

順勢康膠囊（批號：160320、160321、160327，海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑，規(guī)格：0.5 g/粒）；黃芪甲苷對照品 （純度：95.8%，批號：110781-201314）、鹽酸麻黃堿對照品（純度：99.7%，批號：171241-201007）、甘草對照藥材 （批號：171241-201007），均購自中國食品藥品檢定研究院；陰性對照制劑由醫(yī)院自制。

乙腈為色譜純級，其余試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別

2.1.1 黃芪

供試品溶液制備：取順勢康膠囊15 粒，傾出內(nèi)容物，研細，混勻，精密稱取4 g，溶解于20 mL 甲醇中，經(jīng)1h 的加熱回流后，過濾，將所得固體物溶解于20 mL 的1%氫氧化鈉溶液中。取水飽和正丁醇液20 mL，振搖提取，分取正丁醇液，水層重復(fù)提取一次，合并正丁醇液，用氨試液20 mL 洗滌兩次，隨即減壓蒸干。所得固體物置于2mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

黃芪甲苷對照品溶液制備：精密稱取黃芪甲苷對照品，將其溶解于適量甲醇中，即得濃度為1 mg·mL-1的黃芪甲苷對照品溶液。

陰性供試品溶液制備： 取缺黃芪陰性樣品，按照供試品溶液制備方法，制得陰性供試品溶液。

薄層色譜鑒別方法： 根據(jù)2015 年版 《中國藥典》四部[2]，將3 μL 黃芪甲苷對照品溶液和5 μL 供試品溶液、缺黃芪陰性供試品溶液點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13∶6∶2）在10 ℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)點樣的薄層板上與對照品溶液色譜對應(yīng)的位置，3 批供試品溶液均出現(xiàn)了顏色相同的斑點，而缺黃芪陰性供試溶液在相同位置上未見相應(yīng)斑點。見圖1。

2.1.2 麻黃

供試品溶液制備：取本品20 粒，傾出內(nèi)容物，研細，混勻，精密稱取8g，加入50mL 沸水溶解，濾過，加入30mL 濃氨溶液，混勻，加入60 mL 乙醚振搖提取，分取乙醚液，揮干，固體物加1 mL 甲醇溶解，即得。

對照品溶液制備：精密稱取鹽酸麻黃堿對照品適量，用適量甲醇溶解，即得濃度為1 mg·mL-1的鹽酸麻黃堿對照品溶液。

陰性供試品溶液制備： 取缺麻黃陰性樣品，按照供試品溶液制備方法，制得陰性供試品溶液。

薄層色譜鑒別方法：根據(jù)2015 年《中國藥典》四部，將2 μL 鹽酸麻黃堿對照溶液和10 μL 供試品溶液、缺麻黃陰性對照溶液分別點于硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（5∶1∶0.1）10 ℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，在薄層板上與對照品溶液色譜對應(yīng)的位置，3 供試品溶液均呈現(xiàn)出顏色相同的斑點，而陰性對照溶液在相同位置上未見相應(yīng)斑點。見圖2。

2.1.3 甘草

供試品溶液制備：取本品15 粒，傾出內(nèi)容物，研細，混勻，精密稱取5 g，加乙醚40 mL 加熱回流1 h，濾過，固體物加甲醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，固體物加水40 mL 溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水溶液洗滌3 次，棄去水溶液，正丁醇液蒸干，固體物加甲醇5 mL 溶解，作為供試品溶液。

甘草藥材溶液制備： 精密稱取甘草藥材0.5 g，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。

陰性供試品溶液制備： 取缺甘草陰性樣品，按照供試品溶液制備方法，制得陰性供試品溶液。

薄層色譜鑒別方法：根據(jù)2015 年《中國藥典》四部，將2 μL 甘草藥材溶液和10 μL 供試品溶液、缺甘草陰性供試品溶液，點于硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外燈（波長365 nm）下檢視，在薄層板上供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而陰性對照溶液在相應(yīng)位置未見斑點。見圖3。

圖1 黃芪TLC 圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Megres C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（35∶65）；蒸發(fā)光散射檢測器檢測（漂移管溫度：100 ℃；載氣流速：3 L·min-1）；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣體積：10～20 μL。理論塔板數(shù)按黃芪甲苷峰計算不低于4000。

2.2.2 溶液的制備

①對照品貯備液制備：精密稱取黃芪甲苷對照品13 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芪甲苷對照品儲備液。

②對照品溶液制備： 精密量取對照品儲備液3 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為黃芪甲苷對照品溶液。

圖2 麻黃TLC 圖

圖3 甘草TLC 圖

③供試品溶液制備： 取本品15 粒，傾出內(nèi)容物，研細，混勻，精密稱取5 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，加熱回流1h，濾過，并用少量甲醇洗滌錐形瓶及濾器，合并濾液與洗液，蒸干，固體物加水20mL微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4 次，每次30 mL，合并提取液，用濃氨溶液洗滌2 次，每次50 mL，棄去濃氨溶液，將正丁醇液蒸干，固體物加甲醇溶解，并定量稀釋至5 mL 量瓶中，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

④陰性供試品溶液制備：取缺黃芪的陰性樣品，按“2.2.2”之③的具體步驟，制得黃芪陰性供試品溶液。

2.2.3 專屬性考察 分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液、供試品溶液以及缺黃芪陰性供試品溶液各10 μL。按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果見圖4。陰性供試品溶液在對照品相同保留時間處未出現(xiàn)對應(yīng)色譜峰，表明陰性無干擾。

圖4 專屬性試驗色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品12.56 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芪甲苷對照品儲備液。分別精密量取黃芪甲苷儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，并各進樣20 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件測定。將對照品色譜峰峰面積作為縱坐標A，對應(yīng)的濃度作為橫坐標C，以繪制黃芪甲苷對照品標準曲線，得黃芪甲苷回歸方程為：

結(jié)果顯示，當樣品中黃芪甲苷的濃度處于50.24～251.2μg·mL-1時，兩者之間存在良好的線性關(guān)系。

2.2.5 進樣精密度試驗 精密吸取150.72 μg·mL-1濃度的黃芪甲苷對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算相對標準偏差（RSD）為2.22%，顯示本法有良好的精密度。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取批號為160320 的樣品，根據(jù)“2.2.2”之③的具體步驟，制得黃芪甲苷供試品溶液，將待測樣品置于室溫下放置0、4、6、8、10、12 h 后，按“2.2.1”色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，RSD 為0.78%，表明在室溫條件下放置12 h，供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取6 份批號為160320的供試樣品，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄每個樣品對應(yīng)的黃芪甲苷峰面積，根據(jù)外標法，計算每個樣品中的黃芪甲苷含量。結(jié)果顯示，黃芪甲苷的平均含量為0.0812 mg/粒，RSD 為1.17%。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取12.62 mg 黃芪甲苷對照品置于25 mL 量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.4836 mg·mL-1的對照品溶液。稱取6 份同一批號（批號160320）已知黃芪含量（為0.0810 mg/粒）的樣品2.5 g，再加入1 mL上述對照品溶液，按“2.2.2”之③項下方法制備供試品溶液，將正丁醇液蒸干，加少量甲醇溶解固體物于5 mL 量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。以“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，根據(jù)外標法，計算樣品回收率。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.9 含量測定 按“2.2.2”之③制備3 批（批號160320、160321、160327） 供試品溶液，后再根據(jù)“2.2.1” 項下色譜條件測定3 批供試品溶液中的黃芪甲苷含量。見表2。

表2 3 批順勢康膠囊中黃芪甲苷的含量測定結(jié)果（n=2）

根據(jù)實際生產(chǎn)情況，比較分析3 個批次樣品檢測結(jié)果顯示，以黃芪甲苷含量為參照，本樣品中的黃芪甲苷含量不得低于0.050 mg/粒。

3 討論

黃芪在多個中醫(yī)藥方中均作為君藥，而存在于黃芪中的黃芪甲苷是其主要的活性指標物質(zhì)，在順勢康膠囊的生產(chǎn)中可以作為一項質(zhì)量評價指標。檢測發(fā)現(xiàn)，當波長為202 nm 檢測樣品中的黃芪甲苷含量時，會呈現(xiàn)出一個末端吸收峰，干擾較大。蒸發(fā)光散射檢測器可以消除紫外末端吸收引起的干擾，是檢測黃芪甲苷含量的較好方法[3-5]。

比較了甲醇-水、乙腈-水等不同流動相系統(tǒng)，當采用乙腈-水（35∶65）時，各成分能達到基線分離，黃芪甲苷的峰型好、理論板數(shù)高，因此選用乙腈-水（35∶65）作為流動相。

為進一步檢測所得試驗數(shù)據(jù)的準確性，比較分析了不同水飽和正丁醇溶液提取次數(shù)（3～6 次）對于樣品黃芪甲苷含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 次提取與4 次提取所得黃芪甲苷的含量存在較大的差異，然而繼續(xù)增加提取次數(shù)，所得黃芪甲苷的含量未呈現(xiàn)明顯的遞增趨勢。為能完全地提取黃芪甲苷，同時盡可能節(jié)約試驗資源，故將水飽和正丁醇溶液作為提取試劑，以提取4 次為佳。

順勢康膠囊含有藥味較多，成分復(fù)雜，本研究所建立的黃芪甲苷測定方法結(jié)果穩(wěn)定，專屬性強，可有效地控制該藥品的質(zhì)量。