張月芬，郭 丹，黃 慧，戴雅彬，張慧琳，倪 峰

福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院科技服務中心，福州350101

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是常見的男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，僅次于肺癌，躍居全球男性癌癥的第二位，每年有超過127 萬5 千例的新增病例和35 萬例的死亡病例[1]。其特點是自然病史長且多變，惡性程度高，大多數前列腺癌患者在確診時已經發(fā)生了重要器官和組織的轉移。因此，尋找一種新型藥物來輔助提高前列腺癌的治療效果及改善患者預后，變得尤為重要與迫切。蛇葡萄素（ampelopsin，AMP）又名二氫楊梅素、雙氫楊梅樹皮素、福建茶素、白蘞素等，是葡萄科蛇葡萄屬植物的一種有效黃酮類單體，其化學名為（2R，3R）-3，5，7-三羥基-2-（3，4，5-三羥基苯基） 苯并二氫吡喃-4-酮[2]。據文獻報道，AMP 具有抗腫瘤、抗氧化、保肝護肝、治療腦老化和神經退行性疾病等多種藥理作用[3，4]，具有潛在的開發(fā)利用價值。本課題組最早研究并發(fā)現(xiàn)了蛇葡萄素可抑制人前列腺癌PC-3 細胞的增殖，并誘導其凋亡[5]，而此研究是前期工作的延續(xù)，旨在探討蛇葡萄素對人前列腺癌DU145 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為蛇葡萄素對前列腺癌作用的深入研究和臨床應用提供依據。

1 材 料

1.1 儀器

SW-CJ-1FD 超凈工作臺（蘇凈安泰公司）；Infinite F50 酶標儀 （瑞士Tecan 公司）；DMIL LED 倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司）；CLM-170B-8 二氧化碳培養(yǎng)箱 （新加坡ESCO 公司）；HC-3018R 臺式高速冷凍離心機 （安徽中科中佳科學儀器有限公司）；PowerPac Basic 基礎型蛋白電泳儀、Mini-PROTEAN Tetra Cell 小型垂直電泳槽、GelDoc XR+化學發(fā)光成像系統(tǒng) （均為美國BIO-RAD 公司產品）。

1.2 藥品與試劑

蛇葡萄素（AMP，純度>98%）購自湖南希爾天然藥業(yè)有限公司，實驗前溶于二甲基亞砜（DMSO）中，配制成濃度為100 mg·mL-1的儲備液備用，使用時再用細胞培養(yǎng)基稀釋成所需實驗濃度；RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自以色列BI 公司；CCK-8（Cell Counting Kit-8） 試劑購自東仁化學科技有限公司；Matrigel 基質膠、Transwell 小室購自美國Corning 公司；人轉化生長因子β（TGF-β）重組細胞因子購自美國PeproTech 公司；Vimentin 兔單克隆抗體Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗、Cy3 標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗均購自碧云天生物技術有限公司；E-cadherin 一抗、Vimentin 一抗購自沈陽萬類生物科技有限公司；GAPDH、辣根過氧化物酶標記（HRP-conjugated Affinipure）的山羊抗鼠IgG（H+L）二抗、HRP 標記的山羊抗兔IgG（H+L）二抗，均購自Proteintech 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，購自美國Thermo 公司；PVDF 膜購自德國Millipore 公司；ECL 化學發(fā)光試劑盒，購自蘇州宇恒生物科技有限公司。

1.3 細胞株

人前列腺癌DU145 細胞，購自廣州賽庫生物技術有限公司。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

DU145 細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 天傳代一次，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 CCK-8 實驗

取對數生長期的DU145 細胞，常規(guī)傳代操作、計數，調整成適宜濃度的單細胞懸液，以1×104個細胞/孔接種于96 孔板中，待細胞貼壁后加入各濃度的AMP （0、6.25、12.5、25、50、60、80、100 μg·mL-1），分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，于37 ℃避光繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀于450 nm 波長處測定每孔的吸光度A 值，按下式，計算細胞存活率：

細胞存活率（%）=（A實驗組-A空白調零孔）/（A空白對照組-A空白調零孔）×100%

2.3 克隆形成實驗

將DU145 細胞接種于6 孔板中，細胞貼壁后加入不同濃度的AMP （0、6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后吸棄培養(yǎng)液，用磷酸緩沖液（PBS）清洗2～3 次，胰酶消化成單細胞懸液，計數，于新的6 孔板中以各實驗組按1000 個細胞/孔進行接種，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 天，每2～3 天換液，當培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的集落時終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，用PBS 小心清洗3 遍，用4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛后再用PBS清洗3 遍，用0.1%結晶紫染色20 min，最后用PBS清洗3 遍，晾干后計數、拍照。

2.4 Transwell 實驗

將對數生長期的DU145 細胞接種于6 孔板內，細胞貼壁后加入各濃度的AMP（0、10、20 μg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。此后將細胞常規(guī)消化，收集細胞，離心，PBS 清洗，最后用無血清的培養(yǎng)基重新懸浮細胞，計數。取Transwell 小室，在小室下層加600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，上層加入200 μL 細胞懸液（遷移實驗含1×104個細胞，侵襲實驗含3×104個細胞）。在侵襲實驗中，小室上層加細胞前鋪每孔50 μL Matrigel 膠（按1∶8 比例用無血清RMPI 1640培養(yǎng)基稀釋后使用）。24 h 后取出小室，吸棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗2 遍；0.1%結晶紫染色15 min，PBS 清洗3 遍，用棉簽擦拭小室內面的未穿膜細胞，風干，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。鏡下隨機選取7～10 個視野，計數穿過小室的細胞數目，取平均值用于表示腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

2.5 細胞免疫熒光實驗

將無菌細胞爬片置于6 孔板內，取對數生長期的DU145 細胞，常規(guī)傳代操作，計數，制成單細胞懸液，接種于6 孔板（每孔細胞約1×105個）上。待細胞密度達60%～70%時，更換成無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，讓細胞饑餓24 h。分別加入0、2.5、5、10 ng·mL-1的TGF-β 細胞因子，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸盡培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定液，4 ℃過夜。去固定液，用免疫染色洗滌液搖床上洗3 次，每次5 min。吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗（1∶200 稀釋），4 ℃孵育過夜。去除一抗，用免疫染色洗滌液于搖床上洗滌3 次，每次5 min。去除洗滌液，加入稀釋好的熒光標記的二抗（1∶1000 稀釋）避光搖床上孵育1 h。回收熒光標記二抗，用洗滌液洗滌3 次，每次5 min。滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，于倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.6 Western blot 檢測

取對數生長期細胞，常規(guī)傳代操作，調整成適宜濃度的單細胞懸液，接種于6 孔板上，貼壁后分成對照組、TGF-β 組和TGF-β+AMP 組。TGF-β 組加10 ng·mL-1TGF-β 誘導EMT 模型。TGF-β+AMP組加10 ng·mL-1TGF-β 和25 μg·mL-1AMP。對照組加等體積溶劑。各組隔天換新。48 h 后，收集各組細胞，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上裂解，按BCA 試劑盒說明提取各組細胞總蛋白，并測定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF 膜。PVDF 膜用10%脫脂牛奶封閉非特異性抗原，于室溫下孵育2 h 后分別加入相應濃度的E-cadherin、Vimentin，4 ℃下孵育過夜。TBST 清洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下繼續(xù)孵育1.5 h。TBST 清洗后用ECL 法顯色并曝光成像，以凝膠圖像分析軟件對膠片掃描，以GAPDH 作為內參照，用Image J 軟件分析條帶灰度值，統(tǒng)計目的蛋白的相對表達水平。

2.7 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件和SPSS 25.0 軟件對實驗數據進行處理，計量資料符合正態(tài)分布的數據用均數±標準差（）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 蛇葡萄素對人前列腺癌DU145 細胞增殖能力的影響

3 結果

3.1 AMP 對DU145 細胞增殖能力的影響

采用CCK-8 法分別檢測了不同濃度AMP 在作用24、48、72h 后對前列腺癌DU145 細胞增殖的抑制作用，結果如圖1A 所示。與對照組比較，AMP 25μg·mL-1濃度干預24 h 后細胞存活率開始明顯降低（P<0.05），并且隨著AMP 濃度增加及作用時間的延長，細胞的存活率也進一步降低。利用GraphPad Prism 8.0 軟件擬合獲得劑量反應曲線，計算得24、48、72 h的IC50分別為35.62、32.71、28.43 μg·mL-1。此外，克隆形成實驗結果顯示，12.5、25 μg·mL-1AMP 處理后，細胞的克隆數顯著減少，50、100 μg·mL-1AMP處理后，細胞的克隆數極顯著減少，證實AMP 能夠降低DU145 細胞的集落形成（見圖1B）。

3.2 AMP 對DU145 細胞遷移和侵襲能力的影響

通過Transwell 實驗檢測10、20 μg·mL-1AMP對DU145 細胞遷移和侵襲能力的影響，如圖2 所示。與對照組相比，10、20 μg·mL-1AMP 穿膜細胞數明顯減少，表明AMP 可明顯抑制DU145 細胞的遷移和侵襲能力。

3.3 AMP 對DU145 細胞上皮間質轉化（EMT）模型的影響

TGF-β 處理DU145 細胞48 h 后，顯微鏡下可見大部分細胞形態(tài)變成梭形，呈現(xiàn)間質細胞樣（見圖3B）。而對照組細胞為多角形，形態(tài)偏圓，細胞免疫熒光實驗表征結果顯示，與對照組相比，2.5、5、10ng·mL-1TGF-β 誘導組細胞內的E-cadherin 表達下調，Vimentin 表達上調，尤以10ng·mL-1TGF-β 誘導后上皮-間質轉化EMT 的兩個關鍵指標E-cadherin 和Vimentin 變化最明顯 （見圖3A）。通過進一步的Western blot 實驗檢測，結果如圖3B 所示。與對照組相比，TGF-β 組和TGF-β+AMP 組細胞內E-cadherin表達下調，Vimentin 表達上調，與免疫熒光實驗結果一致。同時，與TGF-β 組相比，TGF-β+AMP 組細胞內E-cadherin 表達變化無統(tǒng)計學差異，但Vimentin表達降低（P<0.05），表明AMP 具有逆轉EMT 過程的作用。

4 討論

AMP 是藥食兩用植物藤茶中含量甚高的一種黃酮類化合物，其食用的安全性也已得到證明[6]。大量的實驗結果顯示，AMP 作為藤茶中的主要生物活性成分，具有安全有效、多途徑多靶點的藥理作用，雖與楊梅素的結構相似，但對前列腺上皮細胞的毒性低于楊梅素[7]。在本研究中，AMP 可有效抑制前列腺癌DU145 細胞的增殖和集落形成，并呈現(xiàn)一定的濃度和時間依賴性，提示AMP 可能對前列腺癌具有一定的治療價值。

圖2 AMP 對人前列腺癌DU145 細胞遷移和侵襲能力的影響

侵襲和轉移是前列腺癌惡化的重要指標，也是導致前列腺癌患者死亡的主要原因，因此，抑制癌細胞侵襲和轉移成為治療前列腺癌的潛在靶點之一[8]。腫瘤細胞遷移和侵襲是一種復雜的生物學行為，主要包括細胞黏附、基質降解和遷移運動等多個環(huán)節(jié)[9,10]。而且腫瘤細胞的遷移和侵襲速度越快，腫瘤轉移能力越強，其惡性程度越高。本研究結果顯示，在Transwell 實驗中，與對照組相比，經AMP 處理后，從上室穿過基底膜的細胞數均顯著減少，并且隨著AMP 濃度增加穿膜細胞數也依次減少，表明了AMP 能夠有效抑制DU145 細胞的遷移和侵襲。

1982 年Greenburg 和Hay 首次提出上皮-間質轉化（EMT）這一概念，是指上皮細胞在一定條件下轉化成間質細胞的過程，使之具有更強的遷移、侵襲及抗凋亡能力，并以上皮表型的缺失和間質表型的獲得為主要特征[11]。上皮源性的惡性腫瘤發(fā)生EMT能夠使腫瘤細胞擺脫細胞-細胞間連接而更具侵襲性，因此在腫瘤的侵襲和轉移過程中起著重要作用。

圖3 AMP 對DU145 細胞上皮間質轉化（EMT）模型的影響

EMT 的主要特點是上皮表型標志物E-cadherin表達減少和間質表型標志物N-cadherin、Vimentin表達增加[12]。轉化生長因子-β（TGF-β）已被證實為多種腫瘤EMT 發(fā)生的主要誘導劑，進而促進腫瘤侵襲轉移[13]。本研究采用TGF-β 為誘導劑，以Ecadherin 表達下調和Vimentin 表達上調為指標，建立了人前列腺癌DU145 細胞的EMT 模型。

本研究還顯示，AMP 干預后可顯著降低TGF-β誘導的前列腺癌細胞EMT 模型的Vimentin 表達，從而抑制EMT 進程，這可能是其抑制人前列腺癌DU145 細胞遷移和侵襲的機制之一。

綜上所述，AMP 能夠有效抑制人前列腺癌DU145 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機制與下調TGF-β 誘導的前列腺癌細胞EMT 模型的Vimentin 表達，進而抑制EMT 進程有關。本研究結果為AMP 作為前列腺癌輔助治療的備選藥物提供了一些實驗依據。當然，AMP 的抗癌作用機制，還有待后續(xù)的進一步深入探討。