董樺 張瑋 榮兵

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院推拿科，天津 300193)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)具有患病率高、病情復(fù)雜、缺乏標(biāo)志物等特點(diǎn)〔1〕。NAFLD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括胰島素抵抗、肝臟脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化等，目前，尚缺少治療NAFLD的特異性藥物〔2〕。藥物治療是當(dāng)前治療NAFLD的首選，但研究發(fā)現(xiàn)，不論是西藥還是中藥在治療NAFLD的過程中均會(huì)產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，因而降低了患者的依從性和療效。因此，積極探索副作用小且療效確切的新方法，對(duì)NAFLD的治療具有重要臨床價(jià)值。揉腹法作為傳統(tǒng)中醫(yī)外治法中的重要一員，可通過刺激腹部胃腸神經(jīng)，調(diào)節(jié)胃腸激素分泌和免疫功能發(fā)揮治療疾病的作用，其具有創(chuàng)傷小、易接受且效果確切等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于慢性淺表性胃炎、小兒積滯、痛經(jīng)、便秘等疾病的治療〔3～5〕。張瑋等〔6〕通過對(duì)61例NAFLD患者分組進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，與西藥組相比，揉腹法組患者可顯著改善患者血脂和肝功能水平、提高NAFLD的臨床療效，提示揉腹法對(duì)NAFLD也具有一定的治療作用，但其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。頂端連接復(fù)合體(AJC)在調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的屏障功能中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)其結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，會(huì)引起腸道炎癥反應(yīng)，使腸道屏障通透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌脂多糖/內(nèi)毒素(LPS)入血，從而破壞胰島細(xì)胞，誘發(fā)機(jī)體胰島素抵抗(IR)，最終造成NAFLD〔7〕。本研究擬在確定揉腹法治療NAFLD大鼠具有確切療效的基礎(chǔ)上，考察其對(duì)大鼠腸黏膜中AJC水平的影響；同時(shí)對(duì)閉合小環(huán)蛋白(ZO)-1，咬合蛋白(Occludin)，上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)，β-連環(huán)蛋白(catenin)，閉合蛋白(Claudin)1等AJC通路相關(guān)信號(hào)分子水平進(jìn)行檢測(cè)，以期獲得揉腹法治療NAFLD的部分可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1大鼠 選取43只健康SD大鼠，雄性，6～8 w，體重200～250 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2018-0024，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-0057，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2018071605，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，期間給予自由飲水和飲食，光照白晝各12 h。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 4%多聚甲醛(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號(hào)：YM-MY803J)；天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、游離脂肪酸(FFA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和三酰甘油(TG )、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為：E-EL-R0355c、E-EL-0047c、E-EL-R0013c、E-EL-R0145c)；FITC-Dextran(美國Chondrex公司，批號(hào)：4009R)；抗ZO-1(單克隆兔抗)、抗Occludin(單克隆鼠抗)、抗β-catenin(單克隆兔抗)、抗E-cadherin抗體(單克隆兔抗)(美國Cell Signaling Technology公司，批號(hào)分別為：43966S、14472S、8480S、13667S)；抗Claudin1(單克隆鼠抗)(美國R&D Systems公司，批號(hào)：MAB4219)；免疫組化試劑盒(北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司，批號(hào)：BF06099)。

1.1.3主要儀器和設(shè)備 SSW-3型顯微外科手術(shù)器械包(上海手術(shù)器械廠)；纖維素濾膜(0.22 μm)、混合纖維素濾膜(0.45 μm)(德國BM公司)；-80℃超低溫冰箱(青島海爾集團(tuán)有限公司)；4℃、-20℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；H1650-W離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；CKX41倒置顯微鏡、IX-71熒光倒置顯微鏡(日本Olympus光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社)；Infinite M1000 Pro全波長酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；TANKPE060高純水機(jī)(美國Millipore公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組和模型建立〔8〕43只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，稱取體重，根據(jù)體重分層隨機(jī)分成：正常對(duì)照組(10只，A組)，造模組(33只)。造模組大鼠喂養(yǎng)高脂飼料進(jìn)行造模；A組大鼠喂養(yǎng)普通飼料，兩組均給予自由飲水。喂養(yǎng)10 w后，從造模組隨機(jī)取3只，驗(yàn)證造模效果，再將造模成功大鼠隨機(jī)分模型組(B組)、揉腹法組(C組)和藥物治療組(D組)各10只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療 A組和B組均不做任何處理。C組〔4〕：采用的推拿方法是和解肝脾腹部推拿法，操作步驟：(1)將大鼠以仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上；(2)操作者站立于大鼠左側(cè)，微屈右手指關(guān)節(jié)使其呈拱手狀，同步彎曲腕關(guān)節(jié)，并攏食指和中指，保持好手型扣于大鼠腹部；(3)來回繞動(dòng)腕關(guān)節(jié)，由食指橈側(cè)和中指指面向食指指面和中指尺側(cè)方向部揉觸腹部，并不停重復(fù)；(4)揉動(dòng)頻率：20～30次/min，10 min/(只·d)，共持續(xù)28 d。D組灌胃給予多烯磷脂酸膽堿0.12 ml/(100 g·d)〔9〕，6次/w，連續(xù)28 d。

1.2.3取材 依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，稱重后，采用7%濃度水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，利用股動(dòng)脈放血處死大鼠，血液靜置30 min后，4℃，2 000 r/min，離心半徑8 cm，進(jìn)行離心，取上清液保存?zhèn)溆?。快速開腹，分離肝臟，稱重，切取肝上葉保存于-80℃冰箱備用，剩余肝組織保存于4%多聚甲醛溶液。分離腸黏膜組織，保存于-80℃冰箱備用。

1.2.4ELISA (1)在微量反應(yīng)板每孔加入待檢標(biāo)本50 μl，設(shè)陽性、陰性對(duì)照各2孔，每孔加入陽性(或陰性)對(duì)照各1滴，并設(shè)空白對(duì)照1孔；(2)每孔加入酶結(jié)合物1滴(空白對(duì)照除外)，充分混勻，封板，置37℃孵育30 min；(3)棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置5 s，甩干，重復(fù)5次后拍干；(4)每孔加顯色劑A液、B液各1滴，充分混勻，封板，置37℃孵育15 min；(5)每孔加終止液1滴，充分混勻；(6)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450 nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值；(7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與評(píng)價(jià)樣品OD值≥2.1陰性對(duì)照平均OD值，判斷為陽性，否則為陰性；陰性對(duì)照OD值<0.05作0.05計(jì)算，>0.05按實(shí)際OD值計(jì)算。

1.2.5蘇木素-伊紅(HE)染色 (1)固定：將取得的大肝組織標(biāo)本放置在4%濃度的甲醛溶液中充分浸泡30～50 min；(2)脫水：分別用70%、80%、90%、95%、100%酒精進(jìn)行梯度脫水；(3)透明：用二甲苯將標(biāo)本透明2次，以替換標(biāo)本組織內(nèi)酒精，此過程需不斷觀察，直至標(biāo)本透明似琥珀；(4)浸蠟：將透明標(biāo)本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65℃下保溫2 h；(5)包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中以后進(jìn)行包埋，待其冷卻凝固以后便成為蠟塊；(6)編號(hào)：記錄為標(biāo)本來源大鼠編號(hào)；(7)切片：標(biāo)本組織蠟塊用切片機(jī)在其中部自動(dòng)橫行切取3張4 μm厚的薄片；(8)貼片：將切片在熱水中燙平，然后再貼在玻片上，置于烤箱58℃恒溫保持4 h；(9)染色：在脫蠟和水洗之后，采用蘇木素進(jìn)行染色，保持3 min，繼續(xù)水洗之后再藍(lán)化，保持10 min，使用1%濃度的鹽酸酒精再進(jìn)行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min；(10)封片：使用70%、80%、90%、95%、100%酒精依次進(jìn)行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進(jìn)行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。采用CKX41倒置顯微鏡精細(xì)觀察肝組織和腸組織病理改變(大鼠回腸組織病理HE染色方法參考肝組織HE染色)。

1.2.6Masson染色法 (1)切片常規(guī)脫蠟至水，用配制好的Weigert鐵蘇木素染色5～10 min；(2)用酸性乙醇分化液分化，水洗；(3)用Masson藍(lán)化液返藍(lán)，水洗；(4)蒸餾水洗1 min；(5)麗春紅品紅染色液染色5～10 min；(6)在上述操作過程中按蒸餾水:弱酸溶液=2∶1比例配制弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min；(7)磷鉬酸溶液洗1～2 min；(8)用配制好的弱酸工作液洗1 min；(9)直接入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2 min；(10)用配制好的弱酸工作液洗1 min；(11)95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s；(12)二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性樹膠封固。采用CKX41倒置顯微鏡精細(xì)觀察并記錄。

1.2.7用異硫氰酸熒光素-葡聚糖(FITC-Dextran) 示蹤法 分離大鼠腸道，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，使用絲線回腸末端進(jìn)行結(jié)扎，然后向腸腔注入FITC-Dextran溶液(使用前利用0.1 mmol/L PBS，配制成20 mg/ml)0.5 ml，再對(duì)升結(jié)腸末端進(jìn)行結(jié)扎。操作時(shí)要注意輕柔，防止腸系膜血管損傷和FITC-Dextran液體泄漏。將包扎好的腸袋放于10 ml生理鹽水中，37℃水浴，60 min。采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光值，計(jì)算生理鹽水中FITC-Dextran含量(含量越高，腸道通透性好)。

1.2.8Western印跡法 采用Western印跡法對(duì)腸黏膜組織中ZO-1，Occludin，E-cadherin，β-catenin，Claudin1中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)。具體步驟：(1)取出大鼠的腸黏膜組織，立即在研磨器內(nèi)加細(xì)胞裂解液放置在冰上進(jìn)行研磨，持續(xù)30 min，將混合液小心吸入到離心管中；(2)將離心管置于低溫高速離心機(jī)內(nèi)，11 000 r/min，4℃離心，持續(xù)15 min，棄沉淀，取上清；(3)將上清液收集起來，二喹啉甲酸(BCA)法定量檢測(cè)蛋白濃度，依照3∶1的比例加入上樣緩沖液，再經(jīng)過沸水浴持續(xù)5 min，進(jìn)行滅活，在-20℃下儲(chǔ)存，以備后續(xù)使用；(4)在110 mV下，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，溴酚藍(lán)區(qū)帶到達(dá)分離膠以后，電壓調(diào)至200 mA，持續(xù)2 h，溴酚藍(lán)區(qū)帶進(jìn)入分離膠末端，并即將泳出分離膠底部，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；(5)按照20∶1的比例在磷酸鹽緩沖液-吐溫20溶液(PBST)溶液中加脫脂奶粉，室溫條件下封閉1 h；依照一抗的推薦濃度和用量，加入奶粉對(duì)一抗進(jìn)行稀釋。將硝酸纖維膜置于雜交袋，加一抗工作液在袋中，然后封口，4℃條件下，孵育過夜；(6)采用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記好的二抗(抗兔IgG抗體，1∶2 000稀釋)工作液，再封口，37℃條件下，孵育1 h；(7)凝膠成像分析儀掃描并分析結(jié)果。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算濃度，結(jié)果用相對(duì)灰度值進(jìn)行表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組肝組織病理學(xué) A組肝臟細(xì)胞完整且排列整齊，肝小葉等結(jié)構(gòu)清晰，肝竇清晰可見，無變性壞死，可見少量細(xì)胞脂質(zhì)沉積。B組可見大量脂肪細(xì)胞變性，呈氣球樣變，肝小葉存在壞死灶和炎性細(xì)胞浸潤及纖維間隔。C組和D組可見少量脂肪細(xì)胞變性和炎細(xì)胞浸潤，但較B組明顯減輕，且C組減輕更為明顯。見圖1。

2.2各組體重、肝濕重比較 與A組比較，B、C、D組大鼠體重和肝濕重均明顯增加，且C、D組大鼠較B組體重和肝濕重明顯降低(P<0.05)，但C和D組之間對(duì)比，體重?zé)o明顯差異(P>0.05)，D組干濕重下降更為顯著(P<0.05)。見表1。

2.3各組AST、FFA、ALT和TG水平比較 與A組比較，B、C、D組AST、FFA、ALT和TG含量均明顯升高(P<0.05)；與B組相比，C、D組AST、FFA、ALT和TG含量均明顯降低(P<0.05)；C和D組各血清學(xué)指標(biāo)均無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組AST、FFA、ALT和TG水平比較

2.4各組腸道黏膜通透性 與A組〔(0.00±0.00)μg/ml〕比較，B、C、D組FITC-Dextran含量均明顯升高〔(0.82±0.10)、(0.56±0.07)、(0.67±0.06)μg/ml，P<0.05〕；與B組相比，C、D組FITC-Dextran含量均明顯降低(P<0.05)，C和D組之間對(duì)比，C組FITC-Dextran下降更為明顯(P<0.05)。

2.5各組回腸組織病理學(xué) A組小腸細(xì)胞形態(tài)正常，B組可見細(xì)胞水腫嚴(yán)重，大量炎性細(xì)胞浸潤，能夠見到壞死脫落細(xì)胞。C組、D組炎癥細(xì)胞減少，水腫程度減輕，未見壞死脫落的上皮細(xì)胞，其中C組尤為明顯。見圖1。

2.6Western印跡檢測(cè)大鼠腸黏膜組織中ZO-1，Occludin，E-cadherin，β-catenin，Claudin1蛋白表達(dá) B、C、D組腸黏膜組織中ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin、Claudin1表達(dá)較A組明顯減少，而C、D組ZO-1、Occludin、E-cadherin、β-catenin、Claudin1表達(dá)量較B組明顯增加(均P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western印跡檢測(cè)腸黏膜組織ZO-1，Occludin，E-cadherin，β-catenin，Claudin1蛋白表達(dá)

表3 各組目標(biāo)蛋白與GAPDH熒光強(qiáng)度比值

3 討 論

胃腸道的上皮黏膜是一道具有調(diào)節(jié)和選擇性滲透的屏障，可允許營養(yǎng)物質(zhì)，離子和水被動(dòng)進(jìn)入，同時(shí)限制病原體進(jìn)入皮下組織。腸上皮細(xì)胞的屏障功能大量生理和病理因素影響，同時(shí)受到一種頂端細(xì)胞間連接蛋白復(fù)合物的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，該復(fù)合物簡稱AJC。AJC由緊密連接(TJ)及其下面的頂部的黏附連接(AJ)構(gòu)成。AJ主要作用是防止外來抗原，微生物及其毒素等腸腔內(nèi)的有害物通過，同時(shí)允許必要的電解質(zhì)，營養(yǎng)素和水由腸腔進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)〔10〕。TJ主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的間隙，限制大分子和病原體的通過〔11〕。AJC發(fā)生破壞時(shí)，易引發(fā)炎癥加重、感染和腸道吸收障礙等，與胃炎、肝病、腹瀉及克羅恩病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔12～14〕。

Claudin、Occludin及ZO家族蛋白是構(gòu)成TJ的主要蛋白，而AJs的結(jié)構(gòu)主要由β-catenins和E-cadherin等蛋白組成。陳景杰等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)，豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞中Occludin、Claudin和ZO-1基因表達(dá)水平會(huì)明顯下降。姜永帥等〔16〕通過建立大鼠膿毒癥模型發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組大鼠腸道中Claudin-1、Occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)水平明顯減少。Yang等〔17〕研究也發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓神經(jīng)炎性白質(zhì)損傷大鼠的血管緊密連接破壞被破壞，TJ相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯下降。邊志斌等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中β-catenin、c-myc表達(dá)與細(xì)胞分化呈正相關(guān)，E-cadherin表達(dá)與其呈負(fù)相關(guān)。Harosh-Davidovich等〔19〕研究也發(fā)現(xiàn)，直腸癌患者腸組織中的β-catenins和E-cadherin水平明顯下降，且與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。以上研究表明，AJC相關(guān)蛋白的水平改變?cè)诙喾N疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

揉腹法作為傳統(tǒng)中醫(yī)外治法中的重要一員，可通過刺激腹部胃腸神經(jīng)，調(diào)節(jié)胃腸激素分泌和免疫功能發(fā)揮治療疾病的作用，其具有創(chuàng)傷小、易接受且效果確切等優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于慢性淺表性胃炎、小兒積滯、痛經(jīng)、便秘等疾病的治療。張瑋等〔6〕通過對(duì)61例NAFLD患者分組進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，與西藥組相比，揉腹法組患者可顯著改善患者血脂和肝功能水平、提高NAFLD的臨床療效，提示揉腹法對(duì)NAFLD也具有一定的治療作用。本研究結(jié)果證明揉腹法在治療NAFLD中具有一定的應(yīng)用前景。同時(shí)，本研究結(jié)果提示揉腹法治療NAFLD的機(jī)制可能與激活ZO-1信號(hào)通路，促進(jìn)AJC組裝有關(guān)。

綜上，揉腹法可改善NAFLD誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷，其機(jī)制可能可能與激活ZO-1信號(hào)通路，促進(jìn)AJC組裝有關(guān)。本研究雖證實(shí)揉腹法能夠在一定程度上發(fā)揮治療大鼠NAFLD作用，但由于樣本量有限，實(shí)驗(yàn)方法單一，且NAFLD發(fā)病復(fù)雜，仍需更大的樣本量、更豐富的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。