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禽白血病是由禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）引起的一種以免疫抑制、生長抑制和髓細(xì)胞癌變?yōu)樘攸c(diǎn)的傳染性致骨髓細(xì)胞瘤疾病或成髓性白血病[1]。家禽活疫苗中ALV 的污染和傳播是引起禽白血病流行的重要原因。因此，家禽活疫苗中ALV 污染檢測對提高生物制品安全性非常重要[2]。

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法是具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單、所需設(shè)備較少、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來病毒檢測方法中發(fā)展最快，應(yīng)用最廣的一種方法。用ELISA 法測定家禽活疫苗中ALV 污染狀況，其測量結(jié)果的可信度很大程度上取決于不確定度的大小。測量不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理賦予被測量值的分散性。測量不確定度用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示時(shí)，稱為標(biāo)準(zhǔn)不確定度，如用說明了置信水準(zhǔn)區(qū)間的半寬度表示方法，則為擴(kuò)展不確定度。在家禽活疫苗的ALV 污染檢測結(jié)果中引入測量不確定度[3-4]，目的在于分析不確定度的來源并對其量化，有助于檢測人員關(guān)注檢測關(guān)鍵環(huán)節(jié)，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，并為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)工作提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 雞新城疫活疫苗（La Sota 株）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120 株）、雞傳染性法氏囊活疫苗（B87 株）和“雞新城疫、傳染性支氣管炎”二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+QXL87 株）。

1.1.2 試劑 ALV ELISA 檢測試劑盒、雞新城疫病毒陽性血清、雞傳染性法氏囊病毒陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀（型號SUNRISE），瑞士Tecan 公司產(chǎn)品；10～100 μL 單道移液器、30～300 μL多道移液器，Eppendorf 公司產(chǎn)品；恒溫生化培養(yǎng)箱（型號SHP-150），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 每批疫苗按照2015年版《中華人民共和國獸藥典》三部附錄中的ALV 檢驗(yàn)法處理并接種雞胚成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)5 d，按常規(guī)方法消化、收獲細(xì)胞；將其中1/2 收獲的細(xì)胞作為第一代細(xì)胞培養(yǎng)物（P1樣品），其余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d 后，按同樣方法收獲細(xì)胞，作為第二代細(xì)胞培養(yǎng)物（P2樣品）。按同樣方法培養(yǎng)收獲第三代細(xì)胞培養(yǎng)物（P3樣品）[5]。將連續(xù)3 代細(xì)胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品反復(fù)凍融3 次，離心，取上清作為每批疫苗的待檢樣品。

1.2.2 測量不確定度來源分析 測量不確定度評定分為：A 類評定（uA），即重復(fù)樣本檢測引入的不確定度；B 類評定（uB），即可能影響測量結(jié)果的因素。根據(jù)檢測原理、試劑盒說明書分析，本試驗(yàn)的不確定度主要是移液器加樣量、溫育時(shí)間、溫育溫度、酶標(biāo)儀測量。

1.2.3 測量不確定評定

1.2.3.1 測量樣品重復(fù)性引入的不確定度評定利用ALV ELISA 檢測試劑盒檢測各樣品的OD650nm值，每批疫苗的連續(xù)3 代細(xì)胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品分別重復(fù)測定6 次[5]，按照文獻(xiàn)[3]計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。其中，為樣品平均值，Sxi為樣品重復(fù)檢測的標(biāo)準(zhǔn)差，xi為每次重復(fù)的測量值，n為重復(fù)次數(shù)。

1.2.3.2 移液器加樣引入的不確定度評定 移液器加樣產(chǎn)生的不確定度包括移液器容量誤差產(chǎn)生的不確定度uC和溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度uT[3，6-7]。移液器容量誤差產(chǎn)生的不確定度uC，根據(jù)移液器校準(zhǔn)證書獲得100 μL 和300 μL 移液器在100 μL檢定點(diǎn)的容量允許誤差為±2%，按矩形分布處理計(jì)算uC=（100 μL×2%）。溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度uT，設(shè)定溫度為20 ℃時(shí)水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，實(shí)驗(yàn)室溫度為（20±4）℃，ELISA試驗(yàn)中每次加樣量為100 μL，按照矩形分布計(jì)算uT=100 μL×4×2.1×10-4。由于移液器容量誤差和溫度效應(yīng)是2 個(gè)相互獨(dú)立的分量，故移液器加樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。本次試驗(yàn)共有4 步加樣過程（100 μL 樣品、100 μL 酶結(jié)合物、100 μL 顯色液、100 μL 終止液），且相互獨(dú)立，故加樣過程中引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB1=uV2/100 μL。

1.2.3.3 酶標(biāo)儀產(chǎn)生的不確定度評定 依據(jù)酶標(biāo)儀校準(zhǔn)證書，設(shè)定吸光度的示值誤差為0.004，按照均勻統(tǒng)計(jì)分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，按照文獻(xiàn)[6-7]計(jì)算酶標(biāo)儀對每個(gè)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

1.2.3.4 溫育時(shí)間的不確定度評定 ELISA 試驗(yàn)中，孵育時(shí)間為（60±2）min，按照均勻統(tǒng)計(jì)分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，共孵育2 次，依據(jù)文獻(xiàn)[3]計(jì)算溫育時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

1.2.3.5 溫育溫度的不確定度評定 ELISA 試驗(yàn)共需孵育2 次，孵育的溫度均為37 ℃，在使用電熱恒溫培養(yǎng)箱時(shí)，溫度波動(dòng)范圍為±1 ℃，根據(jù)均勻統(tǒng)計(jì)分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，依據(jù)文獻(xiàn)[3]計(jì)算溫育溫度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

1.2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度 因以上各分量互不相關(guān)，故合成不確定度就是將各個(gè)影響因素算出來的不確定度合在一起的過程，即將各個(gè)影響因素不確定度的2 次方加在一起，再開平方根，計(jì)算公式

1.2.5 擴(kuò)展不確定度 擴(kuò)展不確定度（U）以標(biāo)準(zhǔn)偏差的倍數(shù)表示。在ELISA 試驗(yàn)中一般使用2倍擴(kuò)展不確定度，即k=2。當(dāng)置信概率p=95%時(shí)，包含因子k=2，U=u×k，計(jì)算每批疫苗連續(xù)3 代細(xì)胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品的擴(kuò)展不確定度。

1.2.6 測量不確定度報(bào)告 得出ELISA 試驗(yàn)的不確定度后，表示為X=x±U。x為實(shí)際樣品的OD650nm值，U為不確定度，X表示被檢樣品的標(biāo)準(zhǔn)的OD650nm值所在的區(qū)間。

1.2.7 檢測結(jié)果判定 根據(jù)ALV ELISA 試劑盒的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，待檢樣品OD650nm值大于或等于0.300 判為陽性，小于0.300 判為陰性。如果疫苗的連續(xù)3 代細(xì)胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品的OD650nm值都小于0.300，即這批疫苗沒有ALV 污染；疫苗的連續(xù)3 代細(xì)胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品中只要有1個(gè)樣品的OD650nm值大于或等于0.300，即可判定這批疫苗有ALV 污染。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量評定

2.1.1 測量樣品重復(fù)性引入的不確定度評定 為獲得重復(fù)性測量不確定度，對同一樣品進(jìn)行6 次測定，測量值xi、平均值X、標(biāo)準(zhǔn)差Sxi、標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uA1的結(jié)果見表1～4。從表中可以看出，每個(gè)樣品重復(fù)測定6 次，測量值xi是不相同的。測量不確定度用標(biāo)準(zhǔn)差表示時(shí)，就是標(biāo)準(zhǔn)不確定度，反應(yīng)每個(gè)樣品測量值的分散性。標(biāo)準(zhǔn)不確定度除以平均值就是相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，4 批疫苗的每個(gè)樣品相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度范圍在0.02～0.04 之間。

表3 雞傳染性法氏囊活疫苗（B87 株）樣品重復(fù)測定結(jié)果（n=6）

表4 雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+QXL87 株）樣品重復(fù)測定結(jié)果（n=6）

2.1.2 移液器加樣引入的不確定度評定

2.1.2.1 容量誤差產(chǎn)生的不確定度 根據(jù)移液器容量允許誤差，按矩形分布處理計(jì)算的移液器引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.1.2.2 溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度 依據(jù)20 ℃時(shí)水的膨脹系數(shù)、實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)范圍，按照矩形分布計(jì)算的溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uT=100 μL×4×2.1×10-4=0.084 μL。

2.1.2.3 加樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度 移液器加樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由移液器容量誤差和溫度效應(yīng)2 個(gè)相互獨(dú)立的分量，按公式計(jì)算得出，

2.1.2.4 加樣引入的綜合標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度 本試驗(yàn)共有4 步加樣過程且相互獨(dú)立，故加樣過程中引入的綜合標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uB1=uV2/100 μL=2.315 504 μL/100 μL=0.023 155。4 批疫苗每個(gè)樣品移液器加樣的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度都相同，均為0.023 155。

2.1.3 酶標(biāo)儀產(chǎn)生的不確定度評定 酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)證書給出吸光度的示值誤差為0.004，按照均勻統(tǒng)計(jì)分布計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)差為，計(jì)算得出酶標(biāo)儀對每個(gè)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。測量每個(gè)樣品的酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)差相同，但每個(gè)樣品的平均值不同，導(dǎo)致酶標(biāo)儀對每個(gè)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度不同，由表5 可見，4 批疫苗的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度在0.038～0.046之間。

2.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)公式計(jì)算每批疫苗樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表6～9。從表中可以看出，樣品的平均值在0.050～0.060 之間，樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度在0.003～0.004 之間。

2.3 擴(kuò)展不確定度

當(dāng)置信概率p=95%時(shí)，包含因子k=2，根據(jù)公式U=u×k，計(jì)算每批疫苗每個(gè)樣品的擴(kuò)展不確定度，結(jié)果見表6～9。從表中可以看出，樣品的平均值X范圍在0.050～0.060 之間，樣品的擴(kuò)展不確定度在0.007～0.008 之間。

2.4 測量不確定度報(bào)告

用測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)形式X=x±U表示每批家禽活疫苗每個(gè)樣品測量結(jié)果，并進(jìn)行有效數(shù)字修正，結(jié)果見表6～9。

2.5 檢測結(jié)果判定

從表6～9 中可以看出，每批家禽活疫苗的連續(xù)3 代細(xì)胞培養(yǎng)物P1、P2、P3樣品ALV OD650nm值不確定度范圍在0.040～0.070 之間，上限值均小于0.300，判定為陰性，即所檢測4 批活疫苗中沒有ALV 污染。

3 討論

測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征。測量結(jié)果的可信程度在很大程度上取決于其不確定度大小，而測量結(jié)果必須附有不確定度說明才是完整并有意義的。ELISA 檢測中引入測量不確定度的概念后，給ELISA 的檢測值賦予分散性，將檢測值由原來的“點(diǎn)”變?yōu)椤岸巍保捎行Ы档驼`判風(fēng)險(xiǎn)。本研究中，用ELISA 法檢測4 批家禽活疫苗中ALV 污染情況，在測量的OD650nm值中，加入測量不確定度，提升了測量結(jié)果的可信度。杜鵑[6]在口蹄疫病毒O 型抗體液相阻斷ELISA 試驗(yàn)中，引入ELISA 的測量不確定度，提升了測量結(jié)果的可信度，并有效降低了假陽性、假陰性出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)；史喜菊等[8]在牛布魯氏菌補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中，引入測量不確定度，使測量結(jié)果的質(zhì)量判定有了定量依據(jù)。

表5 酶標(biāo)儀對每個(gè)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表6 雞新城疫活疫苗（La Sota 株）樣品各個(gè)不確定度評定結(jié)果

表7 雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120 株）樣品各個(gè)不確定度評定結(jié)果

表8 雞傳染性法氏囊活疫苗（B87 株）樣品各個(gè)不確定度評定結(jié)果

表9 雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+QXL87 株）樣品各個(gè)不確定度評定結(jié)果

本研究中，4 批家禽活疫苗的禽白血病病毒的OD650nm值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.300，加入測量不確定度，對于結(jié)果的判定影響不大。假如測得的樣品OD650nm值接近臨界值0.300，加入測量不確定度，就可以降低誤判風(fēng)險(xiǎn)。家禽活疫苗的外源ALV 的檢驗(yàn)中，加入測量不確定度，可提升測量結(jié)果的可信度和降低誤判風(fēng)險(xiǎn)，排除一切ALV 污染，從而給廣大養(yǎng)殖生產(chǎn)企業(yè)提供真正純凈疫苗，為家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展保駕護(hù)航。

用ELISA 法檢測家禽活疫苗中ALV 污染的不確定度來源多樣，既有樣品重復(fù)檢測引入的A 類不確定度，又有移液器、酶標(biāo)儀及溫育溫度和溫育時(shí)間測量誤差等引入的B 類不確定度。在所討論的影響測定結(jié)果不確定度的因素中，酶標(biāo)儀測量和重復(fù)檢測對不確定度結(jié)果的影響最大；移液器加樣、溫育溫度和溫育時(shí)間對不確定度影響程度較小。酶標(biāo)儀測量引入的不確定度可以通過良好的儀器使用習(xí)慣，嚴(yán)格按照儀器的期間核查規(guī)程、維護(hù)規(guī)程進(jìn)行核查和維護(hù)，并合理利用檢定校準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步減小酶標(biāo)儀測量引入的不確定度；采用ELISA 法測定家禽活疫苗中ALV 污染的過程中，應(yīng)盡可能增加重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)，以減少樣品重復(fù)性試驗(yàn)導(dǎo)致的不確定度，從而減少檢測的總不確定度；應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)反應(yīng)條件，選擇精密度高、誤差小的移液器，從而減小由其引入的不確定度，以提高檢測質(zhì)量。