擺倩文， 張邵博， 李 儒， 馬咸瑩， 諾如·以扎·諾丁， 陳士恩*， 丁功濤*

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030;3.蘭州海關(guān) 技術(shù)中心，甘肅 蘭州 730030；4.馬來西亞標(biāo)準(zhǔn)與工業(yè)科學(xué)研究所 工業(yè)生物技術(shù)研究中心，馬來西亞 雪蘭莪州莎亞南 40700)

角蛋白廣泛存在于生物體中,是一種可再生資源,作為家禽加工的副產(chǎn)品而大量生產(chǎn)，可轉(zhuǎn)化為一種動物能消化的膳食蛋白質(zhì)[1]。在畜禽屠宰場，每年都會有角、羽毛、蹄等畜禽副產(chǎn)物，且大多沒有得到合理的利用與開發(fā)而被廢棄。據(jù)2017年統(tǒng)計，我國一年的畜禽屠宰量高達(dá)約8 363 萬噸，其中牛屠宰后的一些不可食的廢棄物約有65 萬噸，占總量的9%；羊屠宰后的廢棄物約有50 萬噸，占總量的11%；豬屠宰后的廢棄物約有318 萬噸，占總量的8%；家禽屠宰后的羽毛、血等廢棄物約有312 萬噸，占總量的17%。這些廢棄物不僅污染環(huán)境，同時造成資源浪費。因此，為減少污染，提高利用率，促進(jìn)環(huán)境向友好型發(fā)展轉(zhuǎn)變，開發(fā)新的蛋白質(zhì)資源成為當(dāng)今的研究熱點。角蛋白作為一類材料力學(xué)特性良好的生物可降解天然高分子,已經(jīng)在多個領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文對角蛋白的微生物降解及其展望進(jìn)行綜述。

1 角蛋白與角蛋白酶概述

1.1 角蛋白

角蛋白(Keratin)屬于不完全蛋白，不溶于水和酸性溶液，不被一般蛋白酶所分解，實質(zhì)為纖維狀硬蛋白，是人或動物外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，其來源豐富，包括皮膚及皮膚衍生物等[2]，主要存在于人的毛發(fā)，動物的角、蹄、羽毛等副產(chǎn)物中。角蛋白與其他植物源性蛋白、膠原蛋白等相區(qū)別的一個重要特征是其結(jié)構(gòu)中含有大量二硫鍵且富含硫元素2.0%～5.6%，胱氨酸含量約為氨基酸組成的8.2%～15.0%左右，而且角蛋白是一種有較高應(yīng)用價值的生物蛋白，現(xiàn)在國內(nèi)所應(yīng)用的角蛋白基本來源于畜禽的副產(chǎn)物。

角蛋白可以分為α-角蛋白和β-角蛋白。α-角蛋白主要在毛發(fā)、羊毛中[3]，是由α-螺旋構(gòu)象的多肽鏈構(gòu)成，具有很好的伸縮性能；而β-角蛋白廣泛存在于羽毛中，它是反平行式β-折疊片平行的方式堆積成的多層結(jié)構(gòu)，鏈間主要以氫鍵鏈接，層間依靠范德華力維持，且含有大量甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸等，因此抗張強(qiáng)度高，但不能拉伸[4]。角蛋白還可以根據(jù)二硫鍵含量的多少分為軟質(zhì)和硬質(zhì)角蛋白，軟質(zhì)角蛋白是存在于細(xì)胞內(nèi)一些組織中的成分，硬質(zhì)角蛋白一般在畜禽的副產(chǎn)物中。這些角蛋白中的二硫鍵使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，具有抗降解性。蛋白質(zhì)在植物或微生物源性蛋白酶的作用下水解為肽和游離氨基酸，然后氨基酸被降解形成不同的產(chǎn)物，包括氨、有機(jī)酸及生物胺等，但是角蛋白的降解主要是角蛋白酶的作用[5]。

1.2 角蛋白酶

角蛋白酶(Keratinase)為專一性降解角蛋白的一類酶，可由微生物產(chǎn)生，能降解多種可溶性及不可溶的蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、纖維蛋白、角蛋白等[6]。畜禽副產(chǎn)物等的廢棄物得以降解，是依賴于微生物發(fā)酵產(chǎn)生角蛋白酶發(fā)揮作用。據(jù)報道，角蛋白酶可分為天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶[7]。其中，絲氨酸蛋白酶類中角蛋白酶數(shù)量最多，應(yīng)用也廣，主要產(chǎn)自細(xì)菌；金屬蛋白酶類在微生物中也有不少；天冬氨酸蛋白酶類目前只在人體腐生真菌中有發(fā)現(xiàn)，活性中心含有天冬氨酸，可以引起人或動物的某種皮膚病[8]。

1.3 角蛋白的降解方法

一般降解角蛋白的方法有化學(xué)水解、物理機(jī)械水解和利用微生物降解三種。

1．3.1 化學(xué)法 化學(xué)水解法包括酸水解、堿水解，還有化學(xué)還原法、化學(xué)氧化法和銅氨溶液法。酸堿水解過程相似[9]，酸水解是將含有角蛋白的產(chǎn)物與一定比例的酸混合加熱水解，然后加堿中和，破壞產(chǎn)物中角蛋白的二硫鍵來分解角蛋白。化學(xué)還原法就是用還原劑將角蛋白中的二硫鍵還原成巰基，而肽鏈不斷裂，得到可溶性的角蛋白。銅氨溶液法是由于銅氨溶液有很強(qiáng)的堿性且對氫鍵有一定的分解能力，所以可以降解角蛋白。

1.3.2 物理法 物理方法有高壓膨化、高壓水解、擠壓法和擠出法。物理水解角蛋白一般是應(yīng)用加熱(100～200 ℃)、加壓(0.294～0.98 MPa)的方法使角蛋白內(nèi)部的二硫鍵斷裂水解，從而使其變成可溶的、易消化的多肽混合物和游離氨基酸[10]。陳瑩等[7]研究了提取角蛋白的物理方法，通過高壓水解和高壓膨化來降解角蛋白。結(jié)果表明，高壓膨化法所需的壓力、溫度均低于水解法，且耗時短，降解率可達(dá)80%。

1.3.3 微生物法 微生物發(fā)酵法是一種工序相對簡單，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)角蛋白酶對角蛋白進(jìn)行降解的方法。在天然環(huán)境中，自然堆積會發(fā)生水解，說明環(huán)境中存在能降解角蛋白的微生物[11]，微生物分解角蛋白是通過分泌角蛋白酶，將角蛋白酶解為氨基酸等蛋白水解物,使通過微生物發(fā)酵降解畜禽副產(chǎn)物，提取蛋白水解物成為可能。

1.3.4 角蛋白降解方法比較 角蛋白降解方法比較見表1。采用化學(xué)法和物理法，廢棄物的利用率無法保證。所以研究一種既環(huán)保又能提高角蛋白營養(yǎng)價值的方法降解角蛋白促進(jìn)畜禽副產(chǎn)物的利用率成為熱點。

2 微生物發(fā)酵工藝

2.1 工藝流程

原材料及菌株→篩菌(初篩和復(fù)篩)→菌種鑒定→原材料為底物發(fā)酵培養(yǎng)基與條件優(yōu)化→角蛋白降解率。

2.2 不同微生物降解角蛋白

目前已發(fā)現(xiàn)大量能分解角蛋白的微生物，包括部分真菌、放線菌和細(xì)菌，見表2。

表1 角蛋白降解方法比較

Sangali等[25]在厭氧系統(tǒng)中分離出1株弧菌菌株kr2，它是一種能降解角蛋白的中溫細(xì)菌，屬于弧菌科, 是從家禽工業(yè)廢料中分離出降解羽毛的細(xì)菌，該弧菌在含有天然羽毛的肉湯中培養(yǎng)時產(chǎn)生了很高的角質(zhì)溶解活性，細(xì)菌生長的最佳pH值為7，溫度為30 ℃，羽毛粉的消化率高達(dá)82%。Kim等[26]從家禽糞便中分離出降解羽毛的細(xì)菌,在這些分離株中，有3株被鑒定為枯草芽胞桿菌。聶康康[27]以短小芽胞桿菌WHK4為材料，以羽毛作為碳氮源進(jìn)一步發(fā)酵產(chǎn)酶來降解羽毛角蛋白。經(jīng)過優(yōu)化工藝結(jié)果顯示，羽毛角蛋白降解的最佳pH為8.0，菌齡為18 h，搖床180 r/min，發(fā)酵60 h時降解率達(dá)52.0%；如果用羽毛粉代替羽毛，其降解率可達(dá)74.4%。雖然有大量微生物被發(fā)現(xiàn)能降解一些天然角蛋白[28]，但仍然存在對副產(chǎn)物等的廢棄物利用率低的問題，很難廣泛利用，所以要篩選對角蛋白分解率高的菌株。李雷等[29]選用通過紫外和化學(xué)方法誘變得到的具有高活性蛋白酶的菌株，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)UMU4和短小芽胞桿菌(B.pumilus)SCU11，通過種子培養(yǎng)過夜，分兩組實驗，按3%的比例在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入培養(yǎng)好的菌株，37 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵6 d，每天離心取上清液進(jìn)行測定，分析其分解效率、氨基酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株SCU11能更高效地利用羽毛，其羽毛降解率是菌株UMU4的1.2倍，降解率分別為85%和70%，第5天時約有65%的羽毛轉(zhuǎn)化為可溶性肽和氨基酸。傅偉[3]以羽毛作為唯一的碳氮源，地衣芽胞桿菌ZJUQH作為材料菌種，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入羽毛粉，250 mL搖瓶發(fā)酵，4～5 d后羽毛完全被降解。采用正交試驗設(shè)計對幾個主要影響條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)匾卵堪麠U菌細(xì)胞的生長溫度為40 ℃，發(fā)酵時間48 h，反應(yīng)pH值為7.5時，發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果最佳，產(chǎn)角蛋白酶活力高達(dá)85.8 U；而當(dāng)反應(yīng)pH為7.0時，羽毛降解率最高，達(dá)84.06%。

表2 產(chǎn)角蛋白酶的微生物類型

研究發(fā)現(xiàn)降解角蛋白的微生物多存在于細(xì)菌且降解效果最佳。由于細(xì)菌種類較多，生長繁殖快，產(chǎn)量高，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，用于降解角蛋白，所得角蛋白酶活性較真菌和放線菌高且降解率更好。雖然微生物發(fā)酵篩菌過程繁瑣，優(yōu)化工藝復(fù)雜，但是相比較化學(xué)和物理方法，微生物發(fā)酵法消化率較好，效果較好，還能提高廢物利用率保證高營養(yǎng)價值。

2.3 影響微生物發(fā)酵的因素

研究發(fā)現(xiàn)影響微生物發(fā)酵的主要因素為溫度、pH值和接種量，微生物發(fā)酵產(chǎn)酶所需的條件均不相同，但在特定的最優(yōu)條件下，會達(dá)到最佳降解率。蔡成崗[30]測定了pH值對菌株降解羽毛角蛋白的影響，結(jié)果表明，pH值對產(chǎn)酶量和酶活都有影響。在不同pH值條件下，菌株的生長情況不同，pH值在7.5～8.0的中性至弱堿性條件下，產(chǎn)酶量呈上升趨勢；當(dāng)pH值為7.5時，酶活達(dá)到最大；pH值超過8.0，酶活隨著pH值的升高而降低。因此，在微生物發(fā)酵過程中，經(jīng)工藝驗證探究出適宜的發(fā)酵條件極為重要。聶康康[27]測定了溫度對菌株KD-N2降解角蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對于產(chǎn)酶量和酶活均有影響。當(dāng)培養(yǎng)溫度為23 ℃時，菌株KD-N2的產(chǎn)酶率最高；當(dāng)溫度低于23 ℃時，菌株生長速度慢，產(chǎn)酶量降低；當(dāng)溫度超過28 ℃，菌株生長速度快，產(chǎn)酶時間短，但隨著發(fā)酵時間的增加，酶活性降低。所以，要選擇適宜的溫度降解角蛋白。該研究還表明，適量的接種量可以促進(jìn)菌株的生長繁殖，并促進(jìn)角蛋白酶的產(chǎn)量。隨著濃度的增加，角蛋白酶活性降低，接種量在2%時角蛋白酶產(chǎn)量達(dá)到最高。常培偉[31]研究表明，發(fā)酵底物中的碳、氮源對微生物發(fā)酵產(chǎn)酶量有影響。碳源是組成培養(yǎng)基的主要成分之一，其主要功能是提供微生物菌體生長繁殖所需必要營養(yǎng)物質(zhì)，合成菌體所需的碳骨架以及提供菌體合成目的產(chǎn)物的原料。氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)(氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物[32]。徐恒星等[33]實驗結(jié)果表明，葡萄糖作為輔助性碳源對菌體降解角蛋白具有明顯促進(jìn)作用，麥芽糖和乳糖則抑制降解，而輔助性的氮源對降解角蛋白不利。

3 角蛋白的應(yīng)用

3.1 農(nóng)業(yè)

我國每年都會因大量富含角蛋白的廢棄物而造成環(huán)境污染，通過降解角蛋白來獲得所需的產(chǎn)物，會產(chǎn)生角蛋白酶，增加土壤肥性，使角蛋白得以利用。含氨基酸水溶肥料是新一代集高科技多功能與環(huán)保于一體的液體肥料，可為植物提供更全面的營養(yǎng)，可做葉面肥、濃縮肥、液態(tài)肥原料。張榮飛等[34]研究結(jié)果顯示，添加0.08%～0.12% 的角蛋白酶可以顯著提高斷奶仔豬的日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率，且血清中的白蛋白水平提高了20%。

3.2 飼料

動物的飼料大多是由谷類、蔬菜及肉類組成，但是這些物質(zhì)很難被吸收消化。而角蛋白水解物中富含大量游離氨基酸，可溶性蛋白和游離氨基酸可豐富飼料營養(yǎng)，經(jīng)過降解之后能給動物提供營養(yǎng)，促進(jìn)氨基酸的吸收，使動物生長得更好，從而增加了飼料的利用率。

3.3 其他

角蛋白在其他領(lǐng)域也有應(yīng)用，如化妝品、紡織品、醫(yī)用等。角蛋白具有良好的親膚性和吸附性，應(yīng)用于化妝品，能幫助活性因子透過皮膚屏障，實現(xiàn)皮膚的深層護(hù)理，在皮膚美容領(lǐng)域具有良好的前景[35-37]。利用角蛋白酶對角蛋白的特異酶解反應(yīng)對副產(chǎn)物進(jìn)行加工，使其結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變,可改善營養(yǎng)功能[38-40]。同時可溶性蛋白作為填充劑應(yīng)用于皮革，能賦予皮革較好的柔軟性和豐滿性，高活力的角蛋白酶可應(yīng)用到皮革脫毛以及醫(yī)藥等行業(yè)。

4 展 望

天然的動物角蛋白存在范圍較廣，能應(yīng)用于各種行業(yè)領(lǐng)域。因具有優(yōu)異的生物學(xué)特性和良好的材料力學(xué)性能，角蛋白已經(jīng)在材料、生物、醫(yī)學(xué)等方面得到比較廣泛的應(yīng)用且擁有良好的前景。在我國屠宰場廢棄物是角蛋白的一大產(chǎn)源地，但卻不能很好地利用，這限制了角蛋白在工業(yè)化生產(chǎn)中的實際應(yīng)用。為了提高畜禽廢棄物利用率，增加角蛋白的營養(yǎng)價值，產(chǎn)生高效能角蛋白酶，讓角蛋白更多地應(yīng)用在各行各業(yè)，將角蛋白的綜合利用價值挖掘出來，將會是一個很有前景的環(huán)保舉措；選擇高效降解角蛋白的菌株是微生物發(fā)酵的重要前提，開發(fā)出降解效率高、加工工藝簡單且成本低的產(chǎn)品及微生物蛋白水解物酶的生物學(xué)特性研究仍是今后的研究熱點。