宋家梁， 張汝毅， 鄒 斌， 全哲學(xué)

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 上海 200438)

自然水體是各種生命活動的主要場所之一，其中包含各種大小的微生物。它們在地球物質(zhì)循環(huán)、能量流動中起到巨大作用[1-2]，與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)。在制藥生產(chǎn)和科研領(lǐng)域一般使用截留孔徑為0.22 μm的過濾膜作為除菌手段之一。但有研究者不斷發(fā)現(xiàn)能穿透0.22 μm過濾膜的新類型微生物，稱之為超微小微生物[3-4]，這已成為一個熱門而富有挑戰(zhàn)的研究方向。一項格陵蘭島冰川微生物類群研究中發(fā)現(xiàn)某些超微小微生物能夠在冰川中聚集形成狹窄的液體脈路，以非常低的速率進行代謝，該微生物很好地適應(yīng)了冰川中的多種惡劣環(huán)境[5]。美國研究者在一個冰湖水下16 m鹽鹵水中提取到的樣品中也發(fā)現(xiàn)了一些超微小微生物[6]，這些研究認為超微小微生物是受嚴酷的環(huán)境壓力和生命周期等因素影響而呈現(xiàn)超微小的狀態(tài)。此外地下水[4]和熱液口[7]環(huán)境中也發(fā)現(xiàn)了超微小微生物。超微小微生物不僅包括一般細菌，還包括放線菌[8]和古生菌[9-10]。美國加州大學(xué)Banfield課題組對地下深井中的超微小微生物宏基因組分析，發(fā)現(xiàn)了由15個以上候選門組成的細菌超門，并通過地下水樣品的進一步分析發(fā)現(xiàn)了47個新的細菌候選門[11-12]。常見的水體微生物研究多著眼于某類水體，基于分級過濾對不同自然水體中的微生物群落進行比較分析的研究相對少見。本研究選擇上海市周邊秋季的湖水、河水、海(岸)水、井水這四類自然水體各取兩處樣品，共8個水樣。通過一套自主研制的半自動分級過濾裝置將水體中的微生物在1.2、0.22、0.1 μm三級不同截留孔徑、不同過濾面積的膜上分離富集，使用原核微生物16S rRNA基因通用引物進行擴增，并高通量測序，分析了不同水體的微生物群落結(jié)構(gòu)和超微小原核微生物的優(yōu)勢群落類型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水樣 每類自然水體采集兩個不同地點的水樣各15 L，水樣編號與采水點地理位置見表1。測序樣品編號，首字母代表水樣類型，后綴“A”代表0.1 μm孔徑過濾膜，“B”為0.22 μm孔徑過濾膜，“C”為1.2 μm孔徑過濾膜，例如“W1A”代表井水1號水樣0.1 μm孔徑過濾膜截留的微生物樣品。

1.1.2 儀器與設(shè)備 自制半自動分級過濾裝置(見圖1)：聚丙烯材質(zhì)管路；自吸式隔膜泵(EC-304-50B，佛山市三角洲電器科技有限公司)；壓力表(Y-100型，常州朗德壓力表有限公司)；壓力開關(guān)(HPS-1，浙江科博電器有限公司)；5 μm預(yù)澄清過濾器(PS5-10，濱特爾水處理有限公司)；316 L不銹鋼碟片式過濾器(定制，適合于142 mm直徑膜片，海鹽新東方塑化科技有限公司)；東勝龍PCR儀(EDC-810，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；核酸電泳裝置；pH儀(FE28-Standard,梅特勒-托利多)；電導(dǎo)儀(FE38-Standard,梅特勒-托利多)；超凈臺等。

圖1 半自動分級過濾裝置管路及儀表流程圖Fig.1 Piping & instrumentation diagram of semi-auto grading filtration device

1.1.3 耗材 分級過濾主要使用1.2 μm (直徑142 mm)、0.22 μm (直徑142 mm)、0.1 μm (直徑47 mm)3種孔徑聚醚砜過濾膜(Pall Filtration, Port Washington, New York, USA)，DNA的提取使用DNeasy PowerSoil DNA提取試劑盒(QIAGEN, Hilden, Germany)；KAPALTP Libray試劑盒(Kapa Biosystems, Wilmington, Massachusetts, USA)。

表1 四類自然水體8個水樣

1.2 方法

1.2.1 分級過濾 充分潤濕濾膜并排除管路空氣后進行連續(xù)過濾。在過濾起始、中段、結(jié)束三個時間點測濾速，過濾結(jié)束后將3個孔徑的過濾膜分別保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2.2 提取DNA 每種截留孔徑過濾膜分別剪取半徑為23 mm的半圓型并剪碎，按照DNeasy PowerSoil試劑盒說明書提供的方法提取膜上DNA，但在膜碎片與磁珠混勻震蕩的步驟加長至60 min。從四類水體8個水樣的3個孔徑濾膜中獲得共計24個DNA樣品，因河水1.2 μm樣品R2C在提取DNA過程中被破壞，所以未能包括在后面的分析中。

1.2.3 PCR擴增 使用原核生物通用正向引物Pro341F(5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′)和反向引物Modified Pro806R(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)對提取的23個樣品DNA進行16S rRNA基因V3+V4區(qū)擴增[13-16]，把不同barcode加在反向引物5′端區(qū)分不同樣品，并在barcode和引物之間加入兩個堿基(CA)作為連接。擴增反應(yīng)體系為50 μL，變性溫度95 ℃，退火溫度55 ℃，延伸溫度72 ℃，每步各30 s，共33個循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物直接進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶的位置判斷PCR結(jié)果。

1.2.4 文庫構(gòu)建與高通量測序 依照電泳條帶亮度按比例混樣后電泳切膠回收純化PCR產(chǎn)物。使用KAPA LTP Library 試劑盒進行二代高通量測序文庫構(gòu)建，并使用Illumina Miseq高通量測序平臺測序。相關(guān)序列信息已提交到NCBI (PRJNA576040)。

1.2.5 高通量測序結(jié)果處理 測序獲得的基因序列數(shù)據(jù)，首先使用Fast QC軟件進行整體測序質(zhì)量查看以及污染情況分析。序列整體分析主要使用QIIME(http://www.qiime.org)平臺軟件[17]。使用extract barcodes.py切除barcode序列；使用split libraries fastq.py根據(jù)切下的barcode序列進行分庫；以Greengenes 13.8數(shù)據(jù)庫為參照，使用identify chimeric seqs.py識別并移除嵌合體序列。采用Usearch V6.1方法，以Greengenes數(shù)據(jù)庫作為參考序列[18]，以97%的相似度cut-off，對序列進行可操作分類單元(Operational Taxon Units，OTU)分析。使用SILVA 132數(shù)據(jù)庫注釋OTU代表序列[19-21]，獲取分類信息表。通過各個樣品進行alpha多樣性分析，在計算alpha多樣性的過程中，按照序列數(shù)最低的樣品，對每個樣品進行隨機抽樣后，分別給出Chao1、ACE、Shannon和Simpson數(shù)值。通過主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)描述了各個樣品各孔徑濾膜上微生物群落之間的beta多樣性，展示不同樣品之間的聚類關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水體和不同截留孔徑上的微生物多樣性分析

通過對23個測序樣品高通量測序獲得46萬多條序列，除去Singleton后共獲得14 442個OTU，各樣品測得序列進行抽樣數(shù)為6 000的隨機抽樣后的alpha多樣性見表2。其中井水的Chao1和ACE指數(shù)隨著截留孔徑的縮小而上升，表明井水樣品微小微生物的多樣性更高，特別是井水0.1 μm濾膜的Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù)比其他水體樣本高，說明井水是研究超微小微生物的良好樣本。

表2 四類自然水體多樣性指數(shù)

樣品微生物群落的PCA圖(圖2)表示了各類水體在不同孔徑濾膜上微生物群落之間的聚類關(guān)系。湖水和河水同屬于淡水和地表水，它們的微生物組成更加相似，海(岸)水與井水遠離湖水和河水分別形成獨立的聚類；相比湖水/河水/海(岸)水的不同孔徑，井水中兩個0.1 μm孔徑(W1A、W2A)上所截留微生物群落明顯區(qū)別于0.2 μm、1.2 μm的樣品，結(jié)合alpha多樣性分析的結(jié)果推測，井水中超微小微生物種類更多，具有與其他水樣測序樣品不同的微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖2 四類自然水體PCA圖Fig.2 PCA analysis of four type natural waters

2.2 不同水體和不同截留孔徑上的優(yōu)勢微生物群落組成

由圖3可知，湖水0.1 μm(L1A、L2A)中優(yōu)勢微生物依次是Proteobacteria門(51.8%、55.8%)和Actinobacteria門(44.1%、41.5%)細菌；0.22 μm(L1B、L2B)中優(yōu)勢微生物依次是Actinobacteria門(75.2%、79.7%)與Proteobacteria門(11.6%、8.1%)細菌；1.2 μm(L1C、L2C)中優(yōu)勢微生物依次是Actinobacteria門(50.9%、57.9%)、Proteobacteria門(27.4%、25.5%)和Cyanobacteria門(12.6%、6.0%)細菌。在屬水平，湖水兩個0.1 μm濾膜上優(yōu)勢的微生物均為Proteobacteria門SAR11 Clade目的Clade III，相對豐度為49.7%和54.3%；在0.22 μm和1.2 μm濾膜上均為Actinobacteria門Sporichthyaceae科的HgcI clade，相對豐度均在30%～40%左右。

河水中，0.1 μm(R1A、R2A)中優(yōu)勢微生物依次為Proteobacteria門(51.8%、65.9%)和Actinobacteria門(37.1%、25.1%)細菌；0.22 μm(R1B、R2B)中優(yōu)勢微生物依次是Actinobacteria門(69.1%、48.6%)和Proteobacteria門(21.1%、35.3%)細菌。在屬水平，河水兩個0.1 μm濾膜上優(yōu)勢的屬為Proteobacteria門SAR11 clade目的Clade III，相對豐度為49.4%和40.6%；0.22 μm(R1B、R2B)中優(yōu)勢的屬是Actinobacteria門Sporichthyaceae科的HgcI clade(34.1%、22.1%)和Actinobacteria門Ilumatobacteraceae科的CL500-29 marine group，相對豐度為29.2%和23.8%。河水與湖水不同孔徑上的優(yōu)勢群落有相似性。

圖3 不同截留孔徑樣品中優(yōu)勢原核微生物(門水平)Fig.3 Major prokaryotes in different retention filters (Phylum)

海(岸)水中，0.1 μm兩個樣品(S1A、S2A)中優(yōu)勢微生物依次是Proteobacteria門(53.1%、47.5%)和古菌Nanoarchaeota門(18.9%、27.8%)；0.22 μm(S1B、S2B)中優(yōu)勢微生物是Proteobacteria門細菌(38.0%、60.4%)，其次是Thaumarchaeota門古菌(S1B, 23.9%)或Nanoarchaeota門古菌(S2B，10.7%)；1.2 μm(S1C、S2C)上豐度最高的是Proteobacteria門細菌(47.3%、80.5%)，1.2 μm中第二優(yōu)勢的微生物是Euryarchaeota門古菌(S1C，16.3%)或Bacteroidetes門細菌(S2C，5.4%)。在屬水平，海(岸)水樣品兩個0.1 μm(S1A、S2A)上優(yōu)勢的屬為Proteobacteria門SAR11 clade的Clade Ia，相對豐度為34.6%和32.1%，以及Nanoarchaeota門Woesearchaeia古菌(17.7%、27.1%)；但S1樣品和S2樣品在0.22 μm和1.2 μm濾膜上的屬水平優(yōu)勢微生物差異較大，S1B優(yōu)勢的屬是相對豐度為23.2%的Thaumarchaeota 門Nitrosopumilaceae科CandidatusNitrosopumilus屬，S2B優(yōu)勢的屬是相對豐度為17.5%的Proteobacteria門Rhodobacteraceae科Marivivens屬；S1C上優(yōu)勢的屬是Proteobacteria門SAR11 clade目的Clade Ia(18.2%)，S2C上優(yōu)勢的屬是相對豐度為27.6%的Proteobacteria門Rhodobacteraceae科一個未定的屬。S1采自杭州灣遠端的洋山港區(qū)，遠離浦東海岸線近37 km，與采自浦東南匯東灘的海岸水S2優(yōu)勢微生物群落在門水平上有一定的相似性，在屬水平出現(xiàn)差異；但是0.1 μm上的優(yōu)勢微生物的相似性無論是門水平還是屬水平都比更大孔徑高。

井水0.1 μm(W1A、W2A)兩個樣品前四位優(yōu)勢微生物相似，均為Nanoarchaeota門古菌、未定域微生物、Patescibacteria超門和Proteobacteria門細菌，相對豐度合計大于80%。其中W1A和W2A上前三位的優(yōu)勢屬一致，依次為Nanoarchaeota門Woesearchaeia屬古菌(41.0%、34.3%)、未定域微生物(22.1%、21.8%)以及未分類古菌(6.0%、9.7%)。在0.22 μm(W1B、W2B)中優(yōu)勢微生物一致的是Proteobacteria門(46.3%、50.5%)，W1B中第二優(yōu)勢的微生物是Nanoarchaeota門古菌(19.8%)，W2B中第二優(yōu)勢的微生物是Actinobacteria門細菌(29.2%)；W1B上優(yōu)勢的屬是Nanoarchaeota門Woesearchaeia屬古菌(17.5%)，其次是相對豐度16.9%的Proteobacteria門Sphingomonadaceae科未分類細菌，W2B上優(yōu)勢的屬是相對豐度34.7%的Proteobacteria門Burkholderiaceae科未分類細菌，其次是Actinobacteria門Sporichthyaceae科候選屬細菌(14.5%)。在1.2 μm(W1C、W2C)中優(yōu)勢微生物都是Proteobacteria門細菌(41.0%、55.6%)；在W1C中優(yōu)勢的屬是相對豐度9.1%的Acidobacteria門Blastocatellia[Subgroup 4]綱11-24候選屬、Proteobacteria門Xanthobacteraceae科未分類屬(8.7%)、Proteobacteria門Sphingomonadaceae科未分類屬(8.5%)，在W2C上優(yōu)勢的屬是Proteobacteria門Methylomonaceae科未分類屬(15.7%)、Bacteroidetes門Chitinophagaceae科Sediminibacterium屬(14.4%)和Proteobacteria門Sphingomonadaceae科未分類屬(14.2%)。

整合每類水體3個孔徑上古菌的相對豐度，古菌在湖水樣品中僅為1%左右，河水樣品中約為4%，海(岸)水樣品中約為25%，井水樣品中約為23%。在不同截留孔徑上(見圖4)，井水0.1 μm濾膜上的古菌豐度相對于1.2、0.22 μm有明顯的優(yōu)勢，優(yōu)勢種類是一類超微小古菌Nanoarchaeota門[22]，在W1A和W2A中的豐度分別為41%和34%。

圖4 不同截留孔徑樣品中優(yōu)勢古菌豐度Fig.4 Relative abundance of major archaea in different retention filters

在屬水平觀察四類水體0.1 μm上前兩位優(yōu)勢超微小微生物分布其他截留孔徑上的相對豐度，井水中的Nanoarchaeota門Woesearchaeia古菌和一類unclassified的微生物明顯受到孔徑的影響；河水與湖水中的Actinobacteria門Sporichthyaceae科的HgcI clade在3個孔徑上豐度相近，未受不同截留孔徑的影響；河水、湖水和海(岸)水三類水體中都是優(yōu)勢群落的SAR11 clade在0.1 μm上的豐度遠高于0.22 μm，但是1.2 μm上的豐度也略高于0.22 μm。具體數(shù)據(jù)分布見圖5。另外，屬于超微小細菌Patescibacteria超門[4,11,23]在井水中其豐度隨濾膜孔徑的縮小而大幅上升(W1A/B/C：9.3%、2.4%、2.0%；W2A/B/C：20.9%、2.5%、3.7%)。

2.3 未定域原核微生物的分析

井水、海(岸)水中的未定域原核微生物(即軟件分析結(jié)果不能準確定義是屬于細菌域還是古生菌域)相對豐度分別為9%和2%，河水和湖水中則不到1%。進一步細分井水和海(岸)水不同的截留孔徑，海(岸)水S1A中未定域原核生物的相對豐度為3.5%，S2A中為5%；而0.22 μm與1.2 μm樣品中均不到1%；井水W1A中未定域原核微生物的相對豐度為21%，W2A中為20%，而0.22 μm與1.2 μm樣品中均不超過6%，大部分未定域微生物集中在0.1 μm攔截的超微小微生物群落中。

將所有未定域和門水平未分類原核微生物的序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，展現(xiàn)這些未分類微生物與其他各類已知生物之間的親緣關(guān)系。由圖6可知，未定域微生物的16S rRNA基因聚類在古生菌(DPANN超門)附近形成了一個新的簇(Cluster)。

圖5 0.1 μm濾膜上優(yōu)勢原核微生物在分級過濾中的分布(屬水平)Fig.5 Distribution of 0.1 μm retained major prokaryotes in grading filtration (Genus)

圖6 未分類原核微生物系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic trees of unclassified prokaryotes

3 討 論

使用三種不同截留孔徑、不同過濾面積的分級過濾裝置，按照截留孔徑和過濾面積從大到小分級梯度排布，以0.1 μm (直徑47 mm)為終端截留孔徑，并且濾膜過濾面積僅為上游0.22 μm濾膜面積的10%，等同于10倍濃縮了單位水體積里的超微小原核微生物濃度。多層次的分級過濾設(shè)計與傳統(tǒng)的單級過濾相比增加了樣品過濾量(容污量)，從多樣性指數(shù)看也提高了微生物群落的分辨率。相對于更大孔徑，0.1 μm上古菌和未分類或未定域的微生物群落較為豐富。如果沒有引入0.1 μm截留，研究中所發(fā)現(xiàn)的很多超微小微生物可能會被忽略。

本研究驗證了分級過濾能將一些微生物群落根據(jù)尺寸大小進行相對分離的特性，但也發(fā)現(xiàn)并不能按照濾膜的標稱孔徑實現(xiàn)對微生物群落的精準分離[24-26]。一部分微生物群落在不同孔徑上有不同豐度的分布，比如兩個湖水樣品中一類已有報道的超微小微生物Proteobacteria門SAR11 Clade微生物[27]在3個截留孔徑上的豐度大不相同(L1A/B/C：49.7%、4.8%、23.6%；L2A/B/C：54.3%、3.2%、21.2%)，0.1 μm(L1A、L2A)上高達50%的豐度驗證了分級過濾的設(shè)計思想，但在1.2 μm濾膜上出現(xiàn)了比0.22 μm更高的豐度，這可能因為這些微生物更容易附著在顆粒物上或者成簇[28]；同樣湖水樣品中另一類優(yōu)勢微生物Actinobacteria門Sporichthyaceae科hgcI clade屬在3個截留孔徑上的豐度卻都相近(L1A/B/C:41.5%、41.7%、33.8%；L2A/B/C:38.3%、39.6%、30.7%)。這可能是同類微生物在不同生長階段其大小和形態(tài)也可能不同[28]，從而表現(xiàn)出不同的可過濾性。

井水0.1 μm上檢測到的未定域微生物值得深入研究。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看這部分微生物序列單獨聚成一簇，區(qū)分于其他古生菌門?？墒褂萌LrRNA翻轉(zhuǎn)建庫的方法[29]獲取全長rRNA進一步明確其分類地位，并通過宏基因組測序獲得基因組信息，了解這些微生物功能基因以及代謝功能。

0.1～0.22 μm是原核微生物和病毒個體大小的交界區(qū)域[30]，小于0.1 μm粒徑的多是病毒類微生物，所以本研究設(shè)計之初選取了0.1 μm作為超微小微生物終端截留孔徑，而不是更小的截留孔徑，但是否有能穿過0.1 μm截留孔徑的原核微生物，過往有研究和實踐證明了這種可能性的存在[31-35]。未來對于水體超微小微生物群落的研究可以進一步引入小于0.1 μm的納米級過濾膜，比如50 nm和20 nm過濾膜，更小的截留孔徑能更完全地截留更微小的微生物。

但是更小的截留孔徑意味著更大的過濾阻力(反壓)、更慢的過濾速度和更小的單位膜面積處理的水樣體積；這些因素給大體積水體過濾實驗本身帶來挑戰(zhàn)，通過尋找可濾性和截留性能更優(yōu)異的過濾材料以及優(yōu)化實驗工程設(shè)計，比如多級并聯(lián)和分級串聯(lián)過濾的結(jié)合，也許能探索出合適的整體解決方案。