贠 航， 胡閉月， 王 健， 郭仁妹， 王 麗*

(1.蘇州大學 醫(yī)學部護理學院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州硒泰克生物科技有限公司研究中心，江蘇 蘇州 215123)

腸道菌群由寄居在宿主腸道內的各類菌群組成，在宿主免疫調節(jié)、新陳代謝等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。越來越多的證據表明，腸道菌群對人類健康有著潛在的影響。目前發(fā)現，腸道菌群不僅與克羅恩病、潰瘍性結腸炎等胃腸道疾病有關[3-4]，還可能引發(fā)肥胖、糖尿病、高血壓等慢性疾病[5,7]。隨著研究的深入，腸道菌群逐漸成為研究者關注的領域之一。糞便標本是研究腸道菌群的首選，因為它易獲取，且不具有侵入性。通過提取糞便標本中的細菌DNA，并進行高通量測序，是了解腸道菌群多樣性、組成等信息的重要環(huán)節(jié)。但糞便中的細菌DNA穩(wěn)定性差，暴露在空氣中或高溫環(huán)境下易發(fā)生降解。-80 ℃冷凍被認為是保存糞便標本的最佳方法[8]。但在實際研究中，很難即刻收集新鮮標本，多數標本會在室溫或其他環(huán)境下暴露一段時間。如果保存不當，細菌DNA降解會造成標本中菌群種類和多樣性下降，嚴重影響最終的實驗結果。研究指出，糞便標本4 ℃下保存24 h，菌群結構和立即放入-80 ℃凍存相似性較高[9-10]。Tedjo等[11]提出新鮮糞便標本室溫下保存24 h，菌群結構與-80 ℃保存10 min保持高度相似。但同年Bahl等[12]提出，糞便標本于室溫下放置30 min，菌群中擬桿菌數量會明顯減少，而厚壁菌數量會明顯增加。以往研究報道，乙醇可以用來保存動物糞便標本[13-14]，并進行腸道菌群研究。但乙醇是否適合短時間內保存人類糞便標本，相關報道較少。因此，本研究擬用4 ℃、室溫(25 ℃)、無水乙醇依次保存同一受試者的糞便標本，比較3種保存方法對腸道菌群檢測結果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2018年11月在蘇州市雙塔街道衛(wèi)生服務中心招募10名社區(qū)居民作為志愿者，平均年齡(68.38±3.88) 歲。其中，男性4名，女性6名。

1.1.2 試劑與儀器 無水乙醇(市售，中國)，QIAamp PowerFecal DNA Kit試劑(12830-50, QIAGEN公司)，QIAquick PCR purification kit試劑(QIAGEN公司)，PCR擴增所用試劑(PCR-grade water、PCR master mix、Reverse primer、Template DNA)，分光光度計(723型, 上海精密儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1 糞便標本采集 糞便標本由志愿者在家中自行留取，研究人員向其發(fā)放一次性無菌治療巾和5 mL無菌采集管(內含無菌勺)。具體方法：每名志愿者留取當日新鮮糞便置于無菌治療巾上，避免尿液及外界微生物的污染，然后用無菌勺從糞便內部相同部位留取1 g(約黃豆大小)標本放于提前做好標記的采集管內，蓋緊蓋子，共留取6份。其中，2份放于采集管內即可(室溫組)；2份放于研究人員提前倒入3～4 mL無水乙醇的采集管內(無水乙醇組)；2份在室溫組的基礎上，將采集管放入研究人員提前準備好的冰盒中(4 ℃組)。所有標本采集在排便后15 min內完成，并在各自保存方法中保存4 h后，統一放入-80 ℃低溫冰箱凍存。

1.2.2 DNA提取及檢測 糞便標本統一使用QIAamp PowerFecal DNA Kit試劑盒進行細菌DNA提取，并用723型分光光度計檢測提取到的DNA。全部DNA提取完成后，寄送至中國科學技術大學合作實驗室進行PCR擴增和Illumina MiSeq平臺高通量測序。

1.2.3 PCR擴增及高通量測序 使用引物515FB(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA)和806RB(GGACTACNVGGGTWTCTAAT)對細菌16S rRNA V4區(qū)基因進行PCR擴增。擴增試劑：PCR-grade water(13.0 μL)，PCR master mix(10.0 μL)，Forward primer(0.5 μL)，Reverse primer(0.5 μL)，Template DNA(1.0 μL)。擴增程序：94 ℃熱變性3 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火60 s；72 ℃延伸90 s，持續(xù)35個循環(huán)；接著72 ℃延伸10 min，最后4 ℃終止。所有獲得的PCR產物經過QIAquick PCR purification kit 純化后，進行Illumina MiSeq平臺測序。

1.2.4 生物信息學分析 首先使用Trimmomatic軟件對高通量測序獲得的16S rRNA序列進行質量控制，再使用Flash軟件將序列根據overleap關系進行拼接，從而獲取高質量序列。利用Vsearch軟件依照97%相似性對序列進行OTU聚類，聚類時剔除嵌合體。利用Vsearch軟件中的SINTAX算法對OTU序列進行分類學分析，并與Silva數據庫(Silva128)比對，比對閾值為70%，最后獲得每個OTU的注釋信息。讀取結果時，當菌群相對豐度≤0.1%時，歸入Others。通過Mothur軟件獲得Alpha多樣性指數。Qiime軟件計算標本間unweighted unifrac和weighted unifrac距離矩陣，便于繪制PCoA圖形。

1.2.5 統計學分析 采用Origin93_64和SPSS19.0軟件進行數據分析和制圖。計量資料符合正態(tài)分布采用均數±標準差表示，否則用中位數和四分位數間距表示。Alpha多樣性指數比較采用單因素重復測量方差分析，組間兩兩比較采用LSD方法。腸道菌群門水平和屬水平相對豐度比較采用Friedman檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 標本序列及OTUs

本研究30個標本，經測序并對結果進行優(yōu)化后，獲得889 080條高質量16S rRNA序列，平均每個標本29 653條。根據97%的序列相似性聚類，劃分出1 378個OTU。其中，室溫組1 115個OTU，4 ℃組1 125個OTU，無水乙醇組996個OTU，763個OTU 為3組所共有。

2.2 Alpha多樣性分析

由稀釋性曲線(圖1)可知，隨著測序量增大，新增OTU數量逐漸趨于平緩，說明所得測序量合理，可以反映樣本中菌群多樣性。Alpha多樣性包括：Ace、Chao、Shannon以及Simpson指數。其中，Ace和Chao指數反映標本中菌群豐度，即OTU數量。Shannon和Simpson指數反映菌群的多樣性，包括菌群豐度和菌群均勻度。Alpha多樣性分析，各指數具體數值如表1所示，3組Ace、Chao、Shannon以及Simpson指數之間無統計學差異(P>0.05)。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curvesgroup1：室溫組；group2：4 ℃組；group3：無水乙醇組。下圖同group 1 represents the room temperature group, group 2 represents the 4 ℃ group, and group 3 represents the anhydrous ethanol group.The same below

表1 腸道菌群Alpha多樣性指數比較

2.3 腸道菌群門水平比較

腸道菌群門水平分布包括10個門(phylum)，如圖2所示，主要由擬桿菌門(Firmicutes)、厚壁菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、柔膜菌門(Tenericutes)組成。其中，擬桿菌門占比最多，在4 ℃組、室溫組和無水乙醇組分別占68.37%、75.54%、69.94%，厚壁菌門次之，分別占20.82%、13.46%、20.14%。盡管3組保存方法在門分類水平上無統計學差異，但室溫組與4 ℃組和無水乙醇組相比，擬桿菌門相對豐度增加，厚壁菌門相對豐度減少；無水乙醇組變形菌門較4 ℃組和室溫組相對豐度略有增加。

圖2 腸道菌群門水平分布圖Fig.2 Distribution of Gut microbiota in phylum level

2.4 腸道菌群屬水平比較

腸道菌群屬水平分布包括116個屬(genus)，其中36個菌屬相對豐度≥0.1%。如圖3所示，主要由擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、類普雷沃氏菌屬(Parabacteroides)、另枝菌屬(Alistipes)、對位普雷沃氏菌屬(Paraprevotella)、毛螺旋菌屬(Lachnospira)等優(yōu)勢菌屬組成。其中，擬桿菌屬占比最多，在4 ℃組、室溫組、無水乙醇組分別占43.23%、52.49%、43.84%。如表2所示，菌屬相對豐度比較，3組在毛螺旋菌屬、薩特菌屬(Sutterella)、真桿菌屬(Eubacterium)存在差異。具體表現為毛螺旋菌屬在無水乙醇組中相對豐度高于4 ℃組和室溫組(P<0.05)，薩特菌屬在無水乙醇組中相對豐度高于4 ℃組(P<0.05)，而真桿菌屬在無水乙醇組中相對豐度低于室溫組(P<0.05)。

圖3 腸道菌群屬水平分布圖Fig.3 Distribution of Gut microbiota in genus level

表2 腸道菌群屬水平相對豐度比較[%，M(Q25～Q75)]

2.5 基于UniFrac的PCoA分析

基于UniFrac距離繪制PCoA圖形，如圖4所示。PCoA分析可以展示菌群在不同環(huán)境下的相似性和差異性。圖4中每個點都代表1個個體菌群，點與點間距離大小代表菌群之間的相似性，距離越小越相似?；赨niFrac距離的unweighted和weighted主坐標分析，PC1和PC2貢獻率分別為76.87%和8.93%、57.94%和23.69%。不同受試者的標本在相同保存方法下菌群未出現明顯的聚集現象，說明標本間存在個體差異。由圖4A觀察到，3組保存方法有部分重合，說明菌群具有一定相似性。其中，4 ℃組和無水乙醇組相似性較強。UniFrac距離加權后，在圖4B中發(fā)現，10名受試者中有8名受試者標本經4 ℃和無水乙醇保存后菌群呈現出聚集趨勢，說明這兩種方法對同一受試者標本保存效果較為接近。此外，有3名受試者標本經室溫保存后，與4 ℃組和無水乙醇保存相比，菌群出現顯著的離散現象。

圖4 基于UniFrac距離的PCoA分析Fig.4 PCoA analysis based on UniFrac distanceA：未加權距離的PCoA分析；B：加權距離的PCoA分析A：PCoA analysis of unweighted distance；B：PCoA analysis of weighted distance

3 討 論

研究腸道菌群時，糞便標本需要妥善保存，以保證實驗結果的真實性。目前，常見的糞便標本保存方法包括冷凍(-80 ℃或-20 ℃)保存、低溫(4 ℃)保存、室溫保存等。-80 ℃冷凍是保存糞便標本的最佳方法[8]，液氮可以滿足-80 ℃的短期保存，但成本較高，只適合小樣本收集。家庭或醫(yī)院冰箱可以滿足-20 ℃和4 ℃保存，但標本在轉運至-80 ℃凍存過程中，如果脫離低溫環(huán)境，標本可能出現凍融，引起菌群多樣性降低[10]。室溫短期保存糞便標本仍存在一定的爭議。無水乙醇是一種常見的試劑，通過它保存糞便標本，能夠快速凝固標本中的蛋白質，促進DNA水解酶失活[15]，有助于獲得高質量的細菌DNA[16]。但目前使用無水乙醇保存人類糞便并對腸道菌群展開研究的相關報道較少。因此，本研究對4 ℃、室溫以及無水乙醇短期保存的糞便標本進行DNA提取，基于16S rRNA高通量測序，探討3種糞便標本保存方法對腸道菌群檢測結果的影響。

研究結果顯示，3種保存方法對腸道菌群Alpha多樣性和門水平分布的影響無顯著差異。但屬水平分布比較，毛螺旋菌屬在無水乙醇組中相對豐度高于4 ℃組和室溫組，薩特菌屬在無水乙醇組中相對豐度高于4 ℃組。其中，無水乙醇組毛螺旋菌屬相對豐度增加，可能與毛螺旋菌屬能分解乙醇，供其生長發(fā)育有關。薩特菌屬被報道在自閉癥兒童腸道內明顯增多[17-18]。說明當對毛螺旋菌屬和薩特菌屬展開研究時，無水乙醇保存糞便標本可能是最好的選擇。此外，PCoA分析發(fā)現，UniFrac距離加權后，4 ℃和無水乙醇保存同一受試者糞便標本，菌群結果較為接近，室溫保存會導致個別受試者菌群出現離散現象。由此說明相同條件下，無水乙醇和4 ℃保存效果優(yōu)于室溫保存。

低溫保存是冷凍保存(-80 ℃或-20 ℃)外，短期保存糞便標本的主要方法，它能為菌群創(chuàng)造低溫環(huán)境，降低DNA流動性和水解酶活性[19]，但在收集和運輸過程中較為麻煩?；跓o水乙醇保存與4 ℃保存菌群相似性高，通過它替代4 ℃保存糞便標本能夠顯著減少工作量。同類研究指出，糞便標本室溫下(25 ℃)保存24 h菌群結構與原始標本相比，相似度下降到80%以下[20]。而冷凍或乙醇保存標本，菌群結構與新鮮標本最為相似[21-22]，并且乙醇室溫下保存8周，也不會對菌群結構造成明顯改變[21]?？偟膩碚f，使用無水乙醇短期保存糞便標本，腸道菌群多樣性、組成以及結構保持穩(wěn)定，能滿足不同研究的需要。此外，無水乙醇具有價格低廉、易于攜帶等優(yōu)點，適合大樣本量收集標本。因此，當新鮮糞便標本不能立即低溫凍存時，無水乙醇保存可以作為首要選擇。

本研究不足之處主要包括兩方面：首先，研究缺少-20 ℃和-80 ℃冷凍保存作為對照，未能驗證3種保存方法的可靠性。其次，3種保存方法對應的保存時間較為單一，說服力不強。在后續(xù)研究中，將會增設-20 ℃或-80 ℃保存作為對照，同時適當延長各種保存方法的保存時間(如：延長至8、12、24 h等)，進行更加詳細的觀察，尋找最佳保存方法和保存時間的組合。除此之外，還會將這些保存方法應用到不同疾病人群的糞便標本保存當中，以驗證其適用性。