王海平 張素平 闕敢波 張奕平 劉全芳 張洪彬

（福建省龍巖市第二醫(yī)院，福建 龍巖 364000）

靜脈血栓（venous thromboembolism，VTE）作為臨床常見(jiàn)的一種疾病[1]，表現(xiàn)為血液在深靜脈腔內(nèi)異常凝結(jié)和管腔阻塞等造成的回流障礙，同時(shí)可伴有遠(yuǎn)端靜脈高壓、肢體腫脹、疼痛或淺靜脈擴(kuò)張等癥狀。VTE的早期報(bào)道多見(jiàn)于高加索人群。流行性學(xué)數(shù)據(jù)顯示亞洲地區(qū)VTE的病發(fā)率在（14～57）/（1000000人·年），且存在地域差異[2-6]。此外，人口老齡化、手術(shù)復(fù)雜度增加、剖宮產(chǎn)率上升、肥胖、腫瘤患病率上升等諸多因素使得亞洲地區(qū)VTE的發(fā)病率成逐年上升趨勢(shì)，但現(xiàn)有風(fēng)險(xiǎn)因素仍不足以解釋VTE的發(fā)生?？鼓到y(tǒng)是人類(lèi)機(jī)體重要的防御系統(tǒng)，與纖溶系統(tǒng)共同維持機(jī)體出血和缺血之間的平衡。其中，蛋白C作為抗凝系統(tǒng)重要的組成成員，通過(guò)阻斷因子Va和因子VIIIa活性發(fā)揮抗凝作用。此外，蛋白C還參與機(jī)體的一些炎性反應(yīng)。PROC基因編碼蛋白C，位于2q14.3，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少270個(gè)突變位點(diǎn)與蛋白C活性相關(guān)[7]。根據(jù)PROC基因突變情況將蛋白C分為Ⅰ型和Ⅱ型：Ⅰ型表現(xiàn)為蛋白C合成減少，Ⅱ型表現(xiàn)為蛋白C活性降低。565位點(diǎn)突變使得對(duì)應(yīng)堿基由C變?yōu)門(mén)，編碼氨基酸由精氨酸變?yōu)樯彼幔罱K影響蛋白C活性。目前關(guān)于此位點(diǎn)的報(bào)道較少，尤其是在中國(guó)人群。本文我們報(bào)道了福建龍巖地區(qū)一個(gè)家族兩代蛋白C基因565位點(diǎn)突變與VTE的研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 家系一般資料

先證者，男，漢族，31歲，BMI 22.56，平素體健，無(wú)高血壓、糖尿病、高血脂、貧血，無(wú)過(guò)敏史，無(wú)抽煙、飲酒，肝腎功能正常，反復(fù)下肢深靜脈血栓兩次，第一次骨折后左下肢深靜脈血栓，第二次無(wú)誘因出現(xiàn)右下肢腫脹經(jīng)診斷右下肢深靜脈血栓形成。2016-2-13來(lái)我院就診，訴右下肢腫痛2 d。6年前左腳骨折20余天后出現(xiàn)左下肢腫脹疼痛，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷“左下肢深靜脈血栓形成”，予長(zhǎng)期口服華法林鈉2.5 mg qn，期間未規(guī)律監(jiān)測(cè)INR，2年后自行停藥，偶感左下肢酸脹不適。入院行雙下肢靜脈彩超示：右側(cè)髂總靜脈、右下肢靜脈多發(fā)血栓形成；左側(cè)股總、腘靜脈陳舊性血栓形成并血流再通（圖2）。予以達(dá)肝素鈉注射液5000 IU q12h抗凝治療。2016-2-14行“B超引導(dǎo)右小隱靜脈穿刺置血管鞘+下腔靜脈濾器置入術(shù)＋左下肢深靜脈置管溶栓術(shù)”，術(shù)中尿激酶20萬(wàn)單位灌注溶栓，術(shù)后尿激酶溶液25 mL/h經(jīng)溶栓管泵入溶栓治療5 d，達(dá)肝素鈉注射液5000 IU q12h抗凝治療，2016-2-19停用尿激酶，口服華法林鈉片3 mg qn po。2016-2-22局麻下行“下腔靜脈濾器取出術(shù)”。2016-2-23雙下肢靜脈彩超示：右側(cè)髂靜脈、右下肢深靜脈未見(jiàn)明顯血栓；左側(cè)股總、腘靜脈陳舊性血栓形成并血流再通（圖3）?；颊咭蟪鲈海T(mén)診隨訪治療。本研究?jī)?nèi)容獲院內(nèi)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有家族成員均簽署知情同意書(shū)。

1.2 生化指標(biāo)檢測(cè)：收集4位家族成員外周血進(jìn)行生化分析，包括血液細(xì)胞分析（日本Sysmex2100型血球儀）；肝功能8項(xiàng)（羅氏原裝肝功能8項(xiàng)檢測(cè)試劑盒，羅氏C501全自動(dòng)生化儀）、腎功能5項(xiàng)（羅氏原裝腎功能5項(xiàng)檢測(cè)試劑盒，羅氏C501全自動(dòng)生化儀）；凝血四項(xiàng)與D-D二聚體檢測(cè)（檢測(cè)方法：凝固法，上海博研試劑盒，美國(guó)貝克曼公司型號(hào)為ACL TOP 700全自動(dòng)血凝儀）；蛋白C活性、蛋白S活性、AT活性（檢測(cè)方法：發(fā)色底物法，上海博研蛋白C檢測(cè)試劑盒，上海博研蛋白S檢測(cè)試劑盒，上海博研AT-Ⅲ檢測(cè)試劑盒，美國(guó)貝克曼公司ACL TOP700全自動(dòng)血凝儀）。

1.3 蛋白C基因突變檢測(cè)：收集4位家族成員外周血進(jìn)行全基因測(cè)序。PCR反應(yīng)體系10 μL：Vazyme LAmp Master Mix 5μL，ddH2O 3 μL，引物工作液1 μL，樣品DNA 1 μL，PCR過(guò)程：95 ℃ 3 min，95 ℃30 s、68 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min，20 X -0.5 ℃退火/cycles，95 ℃ 30 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min，16 X，72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、割膠后，用瓊脂糖DNA純化試劑盒（上海申能博彩公司）回收并純化，末端標(biāo)記雙脫氧法進(jìn)行正向和（或）反向測(cè)序，對(duì)所發(fā)現(xiàn)的基因突變，重新PCR擴(kuò)增相應(yīng)的片段，反向測(cè)序證實(shí)。

圖1 家系圖

圖2 2016-2-13多普勒彩超圖

圖3 2016-2-23多普勒彩超圖

1.4 抗凝血酶Ⅲ基因突變檢測(cè)：收集4位家族成員外周血進(jìn)行抗凝血酶Ⅲ全基因測(cè)序。PCR反應(yīng)體系10 μL：Premix prime STAR 5 μL，ddH2O 3 μL，引物工作液1 μL，樣品DNA 1 μL，PCR過(guò)程：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s、68 ℃ 15 s、72 ℃ 60 s，20 cycles，95 ℃ 30 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 60 s，16 cycles，72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、割膠后，用瓊脂糖DNA純化試劑盒（上海申能博彩公司）回收并純化，末端標(biāo)記雙脫氧法進(jìn)行正向和（或）反向測(cè)序，使用Chromas軟件將SERPINC1測(cè)序結(jié)果與Genbank序列X68793.1作比對(duì)分析，對(duì)所發(fā)現(xiàn)的基因突變，重新PCR擴(kuò)增相應(yīng)的片段，反向測(cè)序證實(shí)。

2 結(jié)果

2.1 先證者抗凝治療監(jiān)測(cè)：先證者出院后進(jìn)行門(mén)診抗凝治療，服藥期間患者依從性好，定期復(fù)診，INR持續(xù)控制在2.0～3.0（圖4）。

圖4 先證者INR監(jiān)測(cè)統(tǒng)計(jì)圖

2.2 家族成員生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：生化指標(biāo)顯示，先證者除了蛋白C活性下降明顯外，其PT、APTT、TT、FIB、AT、蛋白酶S活性均正常。其他家族成員中，先證者的父親（I-1）和哥哥（Ⅱ-1）的蛋白C均活性均下降，PT、APTT、TT、FIB、AT、蛋白酶S活性均正常（見(jiàn)表1）。

表1 先證者及家系成員生化檢測(cè)

2.3 家族成員蛋白C基因突變檢測(cè)結(jié)果：Chromas軟件分析蛋白C基因檢測(cè)經(jīng)正反測(cè)序結(jié)果：家族4名成員中有3位成員蛋白C基因565位點(diǎn)存在基因突變：先證者的父親（I-1）、先證者的哥哥（Ⅱ-1）和先證者（Ⅱ-2）的蛋白C基因565位點(diǎn)為雜合突變型（圖5）。

圖5 蛋白C基因突變檢測(cè)

2.4 家族成員抗凝血酶Ⅲ基因突變檢測(cè)結(jié)果：全基因組測(cè)序結(jié)果中家系所有成員抗凝血酶基因7個(gè)外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子未發(fā)現(xiàn)異常。

3 討 論

目前，國(guó)內(nèi)外研究逐漸開(kāi)始關(guān)注PROC基因565位點(diǎn)突變與VTE的相關(guān)性。Liang等[7]研究發(fā)現(xiàn)565位點(diǎn)突變與血栓風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，基因突變個(gè)體靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn)增加8.8倍（95%CI:1.1-71.6），攜帶565T等位基因個(gè)體蛋白C缺陷風(fēng)險(xiǎn)增加，檢測(cè)PROC基因?qū)颊哐L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估會(huì)獲益。Tong[8]等研究顯示對(duì)于亞洲人群，565位點(diǎn)突變通過(guò)影響蛋白C活性增加VTE風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于這一位點(diǎn)的突變，亞洲地區(qū)人群應(yīng)更為重視。

本研究報(bào)道了一例家族性蛋白C基因突變與VTE的研究。家族成員中有3位蛋白C基因565位點(diǎn)存在突變。先證者臨床表現(xiàn)為反復(fù)血栓事件發(fā)生，考慮蛋白C基因565位點(diǎn)是血栓高發(fā)的易感因素。介于本研究家族體系人數(shù)的限制，后續(xù)擬將擴(kuò)大人群樣本，在中國(guó)人群中對(duì)蛋白C基因565位點(diǎn)基因多態(tài)性與VTE發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行研究，可能將為VTE的預(yù)防和治療做一提示。