趙 強(qiáng) 劉 樂(lè) 楊 潔 范建鳳 趙二勞

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，忻州 034000)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)又名藜谷、南美藜等，為藜科藜屬雙子葉植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)[1]。藜麥具有豐富而獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為“超級(jí)谷物”“營(yíng)養(yǎng)黃金”[2-4]。我國(guó)1987年開(kāi)始引種，現(xiàn)已在山西、陜西、青海、四川和寧夏等地規(guī)模化種植[5]，資源較為豐富。研究表明[6，7]，藜麥中含有多酚，且藜麥糠中多酚含量更高。多酚是植物次生代謝產(chǎn)物，具有清除自由基抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降血脂以及調(diào)節(jié)人體免疫力等多種功能活性[8-10]，在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。但目前，藜麥糠作為藜麥加工中的副產(chǎn)品，多用作飼料或廢棄，造成資源的極大浪費(fèi)。因此，研究藜麥糠中多酚提取及其生物活性，開(kāi)發(fā)藜麥糠多酚功能產(chǎn)品，對(duì)于提升藜麥綜合利用效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提高藜麥科技附加值，促進(jìn)藜麥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重要的實(shí)際意義。

目前，已有一些有關(guān)藜麥多酚的研究報(bào)道，如盧宇等[8]、闕淼琳等[11]研究了藜麥種子多酚的乙醇浸泡提取工藝，多酚提取率為2.27 mg/g左右；趙寶堂等[12]、陳樹(shù)俊等[13]研究了藜麥種子多酚的超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性，多酚提取率為3.33 mg/g以上；陸敏佳等[1]則研究了幾種藜麥葉片中多酚的提取工藝及其抗氧化活性，多酚提取率為3.815 mg/g以上。但有關(guān)藜麥糠中多酚的超聲輔助提取鮮見(jiàn)報(bào)道?；诔曒o助在天然產(chǎn)物活性成分提取中具有提取時(shí)間短，成本較低，提取率高，不破壞有效成分活性的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[14-16]，本文研究藜麥糠中多酚的超聲輔助提取，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化提取工藝，并以DPPH·和·OH清除率為指標(biāo)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為藜麥糠多酚的深入研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥糠：山西靜樂(lè)藜麥種植基地，粉碎過(guò)60目篩，石油醚浸泡脫脂24 h后，烘箱中60烘干，裝瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、福林酚試劑；沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)、水楊酸、30%過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、碳酸鈉：分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器，723型可見(jiàn)分光光度計(jì)，SHZ-2D循環(huán)水式真空泵，QE-200型藥材粉碎機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 超聲輔助提取工藝

工藝流程：預(yù)處理后藜麥糠→加入溶劑→超聲輔助提取→抽濾→濾液定容→多酚提取液。

主要工藝參數(shù)：預(yù)處理后藜麥糠用量1.0 g，超聲輔助提取1次，提取液定容體積100 mL。

1.2.2 藜麥糠多酚超聲輔助提取單因素實(shí)驗(yàn)1.2.2.1 提取溫度對(duì)藜麥糠中多酚提取率的影響

以50%乙醇為提取劑，料液比(g/mL)1∶35，超聲功率200 W，分別在溫度20、30、40、50、60、70 ℃條件下，超聲輔助提取30 min，研究溫度對(duì)藜麥糠中多酚提取率影響，確定最適提取溫度。

1.2.2.2 超聲功率對(duì)藜麥糠中多酚提取率的影響

以50%乙醇為提取劑，料液比(g/mL)1∶35，提取溫度30 ℃，分別在超聲功率160、200、240、280、320、360 W條件下，超聲輔助提取30 min，研究超聲功率對(duì)藜麥糠中多酚提取率影響，確定最適超聲功率。

1.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)藜麥糠中多酚提取率的影響

以50%乙醇為提取劑，料液比(g/mL)1∶35，提取溫度30℃，超聲功率200 W，分別超聲輔助提取10、20、30、40、50、60 min，研究提取時(shí)間對(duì)藜麥糠中多酚提取率影響，確定最適提取時(shí)間。

1.2.2.4 料液比對(duì)藜麥糠中多酚提取率的影響

以50%乙醇為提取劑，提取溫度30 ℃，超聲功率200 W，分別在料液比(g/mL)1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65和1∶75的條件下，超聲輔助提取30 min，研究料液比對(duì)藜麥糠中多酚提取率影響，確定最適料液比。

1.2.2.5 乙醇濃度對(duì)藜麥糠中多酚提取率的影響

分別以40%、50%、60%、70%、80%和90%乙醇為提取劑，在料液比(g/mL)1∶35，提取溫度30 ℃，超聲功率200 W條件下，超聲輔助提取30 min，研究乙醇濃度對(duì)藜麥糠中多酚提取率影響，確定最適乙醇濃度。

1.2.3 藜麥糠多酚超聲輔助提取的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)藜麥糠多酚提取率影響較大的乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、超聲溫度(C)和料液比(D)4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化藜麥糠多酚超聲輔助提取工藝。選定的因素及水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.4 藜麥糠中多酚提取率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17,18]方法，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，采用Folin-Ciocalteau法測(cè)定藜麥糠多酚提取率。

1.2.4.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取濃度為13.0 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于10 mL比色管中，都加入10%碳酸鈉溶液1.5 mL和福林酚試劑 1 mL，搖勻，去離子水定容至刻度，40 ℃水浴中避光反應(yīng)40 min后，冷卻至室溫，在選定的最大波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定其吸光度。以沒(méi)食子酸對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 藜麥糠中多酚提取率測(cè)定

精密移取適當(dāng)稀釋后的藜麥糠提取液1.0 mL，按1.2.4.1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定其吸光度。按公式計(jì)算多酚提取率。

式中：C為提取液中多酚濃度/μg /mL；V為稀釋后藜麥糠多酚提取液總體積mL；m為藜麥用量/mg。

1.2.5 藜麥糠多酚對(duì)·OH的清除率

實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[19,20]的方法，采用水楊酸法測(cè)定藜麥糠多酚和BHT對(duì)·OH的清除率并計(jì)算其IC50。IC50指對(duì)·OH的清除率達(dá)到50%時(shí)，所需藜麥糠多酚或BHT溶液濃度，IC50值越小，對(duì)·OH清除率越大，抗氧化活性越強(qiáng)。

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：Ai為·OH溶液與加入一定量藜麥糠多酚提取液或BHT溶液體系的吸光度；Aj為僅藜麥糠多酚提取液或BHT溶液體系的吸光度；A0為僅·OH溶液體系的吸光度。

1.2.6 藜麥糠中多酚對(duì)DPPH·清除率的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7,21]的方法，測(cè)定藜麥糠多酚和BHT對(duì)DPPH·的清除率并計(jì)算其IC50。

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為DPPH·溶液與加入一定量藜麥糠多酚提取液或BHT溶液體系的吸光度；A2為僅藜麥糠多酚提取液或BHT溶液體系的吸光度；A0為DPPH·溶液體系的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均為3次測(cè)定的平均值，作圖用Excel，顯著性用SPSS分析(P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著)，Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。沒(méi)食子酸回歸方程：A=0.081 5C+0.010 6，R2=0.999 2，沒(méi)食子酸在0.0～9.1 μg /mL濃度范圍內(nèi)與其吸光度成良好線性關(guān)系。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

提取溫度、超聲功率、提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度對(duì)藜麥糠多酚提取率影響如圖1。

圖2 不同因素對(duì)藜麥糠多酚提取率的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)藜麥糠多酚提取率的影響

由圖1可知，隨提取溫度的升高，藜麥糠中多酚提取率增加，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大，為0.65%。60 ℃后提取率下降。這是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，有利于多酚溶出；但溫度過(guò)高，使乙醇揮發(fā)，且可能會(huì)破壞已提取出的多酚結(jié)構(gòu)[17]，導(dǎo)致藜麥糠多酚提取率降低。因此，選擇60 ℃為最佳提取溫度。

2.2.2 超聲功率對(duì)藜麥糠多酚提取率的影響

由圖1可見(jiàn)，隨超聲功率的增大，藜麥糠多酚提取率先增后降，但整體變化不大。在超聲功率200 W時(shí)，多酚提取率最大，為0.63%?？赡艹暪β蔬^(guò)大會(huì)破壞藜麥多酚結(jié)構(gòu)。因此選擇200 W為最佳超聲功率。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)藜麥糠多酚提取率的影響

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥糠多酚提取率呈先增后降趨勢(shì)。在提取時(shí)間為30 min時(shí)，提取率達(dá)到最大，為0.66%。這是由于提取時(shí)間短，多酚提取不充分，當(dāng)達(dá)到適宜提取時(shí)間后，再延長(zhǎng)提取時(shí)間，多酚在超聲波作用下會(huì)降解，已提出多酚損失，導(dǎo)致多酚提取率下降。故選定30 min為最佳提取時(shí)間。

2.2.4 料液比對(duì)藜麥糠多酚提取率的影響

由圖1可知，隨料液比增加，藜麥糠多酚提取率先增后降，當(dāng)料液比(g/mL)為1∶45時(shí)，多酚提取率達(dá)到峰值0.67%，以后隨料液比增加，多酚提取率降低。其原因可能是在料液比(g/mL)為1∶45時(shí)，對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)的溶解已基本飽和，再增加料液比，其它脂溶性成分增多，與多酚產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)[22，23]，使多酚提取率下降。故選定1∶45為最佳料液比。

2.2.5 乙醇濃度對(duì)藜麥糠多酚提取率的影響

從圖1可知，隨乙醇濃度增加，藜麥糠多酚提取率先增后降，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，多酚提取率達(dá)最大值0.66%，再繼續(xù)增加乙醇濃度，多酚提取率逐漸下降。其原因可能是乙醇濃度過(guò)高，使其它脂溶性物質(zhì)浸出增多，減少了多酚類(lèi)物質(zhì)的溶出[24]。因此，選擇50%為最佳乙醇濃度。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

以多酚提取率為響應(yīng)值，固定超聲功率為200 W，選取對(duì)藜麥糠中多酚提取率影響較大的乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、超聲溫度(C)和料液比(D)4個(gè)因素，設(shè)計(jì)進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化藜麥糠中多酚超聲輔助提取工藝。響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型與方差分析

通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到藜麥糠多酚超聲輔助提取工藝模型的四元二次回歸方程：提取率Y=0.80-0.025A+0.010B+0.014C-0.028D-0.010AB+0.010AC-(1.000E-002)AD+0.040BC+0.025BD-0.017CD-0.021A2-0.071B2-0.055C2-0.080D2，由模型中因素一次項(xiàng)系數(shù)不難發(fā)現(xiàn)，影響藜麥糠多酚提取率的因素大小順序?yàn)椋篋(料液比)>A(乙醇濃度)>C(溫度)>B(提取時(shí)間)。多酚回歸模型的方差分析結(jié)果如表3。

表3 回歸模型方差分析

2.3.3 工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)工藝的可靠性，考慮實(shí)際可操作性，將理論最優(yōu)工藝條件修正為：乙醇濃度44%，提取時(shí)間31 min，溫度61 ℃，料液比(g/mL) 1∶43，超聲功率200 W。3次實(shí)驗(yàn)藜麥糠中多酚提取率分別為0.79%、0.79%和0.80%，平均為0.79%，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.25%，進(jìn)一步表明所建模型的穩(wěn)定可靠，可用于實(shí)際操作。

2.4 藜麥糠多酚抗氧化活性

2.4.1 藜麥糠多酚對(duì)·OH的清除率

藜麥糠多酚和BHT對(duì)·OH的清除率結(jié)果如圖2。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，藜麥糠多酚與BHT對(duì)·OH的清除率都隨濃度的增加而增大，具有明顯量效關(guān)系。求得藜麥糠多酚與BHT的IC50分別為13.52、20.12 μg/mL，顯見(jiàn)，藜麥糠多酚清除·OH 的能力強(qiáng)于BHT，表明藜麥糠多酚具有強(qiáng)的抗氧化活性。

圖3 藜麥糠多酚與BHT對(duì)·OH的清除率

2.4.2 藜麥糠多酚對(duì)DPPH·的清除率

藜麥糠多酚和BHT對(duì)DPPH·的清除率結(jié)果如圖3。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，藜麥糠多酚與BHT對(duì)DPPH·的清除率都隨濃度的增加而增大，具有明顯量效關(guān)系。求得藜麥糠多酚與BHT的IC50分別為2.48、17.33 μg/mL，顯見(jiàn)，藜麥糠多酚清除DPPH·的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于BHT，也表明藜麥糠多酚具有強(qiáng)的抗氧化活性。

圖4 藜麥糠多酚與BHT對(duì)DPPH·的清除率

3 結(jié)論

以藜麥糠中多酚提取率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析優(yōu)化了藜麥糠中多酚超聲輔助提取工藝，確定的最佳工藝條件：乙醇濃度44%，提取時(shí)間31 min，溫度61 ℃，料液比(g/mL)1∶43，超聲功率200 W。該工藝條件下，藜麥糠中多酚提取率為0.79%，與模型理論預(yù)測(cè)值0.80%的相對(duì)誤差為1.25%，表明響應(yīng)面優(yōu)化的藜麥糠多酚提取工藝穩(wěn)定可行?？寡趸钚匝芯堪l(fā)現(xiàn)，藜麥糠多酚對(duì)·OH和DPPH·的IC50分別為13.52、2.48 μg/mL，藜麥多酚具有強(qiáng)的抗氧化活性。本研究為藜麥糠中多酚的提取及其抗氧化活性的深入研究提供了一定的參考，若要達(dá)到藜麥糠多酚的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，還需開(kāi)展藜麥多酚純化及其體內(nèi)抗氧化活性的研究。