梁井瑞 杜 健 高秀華 王 森 李 偉 王 劍 馮曉慧

(棗莊學院食品科學與制藥工程學院，棗莊 277160)

作為嬰幼兒配方奶粉的重要成分之一，二十二碳六烯酸(Docose Hexaenoie Acid，DHA)可促進嬰兒大腦發(fā)育， 提高記憶力[1-4]。微藻油是DHA的主要來源之一[5]，因結構簡單易吸收而得到廣泛應用[6]。但DHA含有多個雙鍵，極易因氧化而變質[7]，喪失生理功效，產生對人體有害的反式脂肪酸和令人反感的腥異味，嚴重影響了其在食品中的應用[8, 9]。通過一定的方式將DHA微膠囊化，可以有效隔絕外界環(huán)境，防止其氧化變質[10, 11]。

微膠囊化是預防油脂氧化的主要措施。微膠囊化是將壁材與DHA油脂混合制成乳狀液，利用噴霧干燥等方法，將DHA油脂液滴包裹成的毫米級微小粒子[12]的過程。微膠囊產品質量與乳狀液穩(wěn)定性緊密相關[13]。

DHA乳狀液是一種典型的食品水包油(O/W)型，屬于熱力學不穩(wěn)定體系[14, 15]。體相溶液中通過機械力使界面形變，從而形成液滴。界面形變過程受到由表面張力引起的拉普拉斯壓力(Laplace pressure)的反作用[16, 17]。液滴過大，與外界環(huán)境有較大接觸面，DHA油脂易被氧化變質[18]。在液滴形成的過程中需要施加外力，使周圍液滴間的黏性力超過拉普拉斯壓力，才能打碎大液滴，形成較小液滴。在制備乳狀液時，應使用膠體磨、高壓均質機等儀器，采用劇烈攪拌的方式來打碎液滴，其過程需要消耗大量能量，才能得到較小的液滴。液滴粒徑越小，乳狀液越穩(wěn)定[18]，拉普拉斯壓力越大。但是，液滴過小，制備過程中劇烈的工藝，如較高的溫度等會顯著影響DHA油脂性質，致其氧化變質。因此，在乳狀液制備過程中，合理的工藝條件對乳狀液穩(wěn)定性及后續(xù)微膠囊產品質量有非常大的影響。

制備DHA微藻油乳狀液多選擇加入表面活性劑、乳化劑等提高乳狀液的穩(wěn)定性，造成流程過程較為復雜，乳狀液的制備成本較高。本研究選用高濃度辛烯基琥珀酸淀粉與麥芽糊精為壁材[19-21]，在不添加任何穩(wěn)定劑的條件下，利用膠體磨、高壓均質機制備乳狀液，以期得到制備成本較低的高穩(wěn)定性乳狀液。以乳狀液穩(wěn)定性和表面張力為綜合評價指標，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優(yōu)化乳狀液制備的工藝條件，旨在制備得到氧化穩(wěn)定性較強的微膠囊產品。通過對工藝優(yōu)化前后微膠囊產品氧化穩(wěn)定性進行分析，為進一步研究高質量的DHA微藻油微膠囊產品提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DHA微藻油(DHA>38%)；辛烯基琥珀酸酯化淀粉(Octenyl Succinic Anhydride Modified Starch, OSA淀粉)、麥芽糊精：食品級；十二烷基硫酸鈉(SDS)、重鉻酸鉀、乙醚、乙醇、氨水：分析純。

1.2 儀器與設備

DJM50L實驗型膠體磨、HP-60-60型高壓均質機、YC-015實驗型噴霧干燥器、Lambda 25紫外可見分光光度計、DDS-11C電導率儀、BZY-1型全自動表面張力儀。

1.3 方法

1.3.1 乳狀液制備

以前期研究結果設定DHA乳狀液的配方[22]。將壁材(OSA 淀粉∶麥芽糊精= 2∶3)與水按照固液比為1∶3進行混合，40 ℃水浴攪拌10 min。加入20%的DHA微藻油，在40 ℃水浴中繼續(xù)攪拌5 min后取出。將預乳液倒入膠體磨中研磨一段時間后取出，倒入高壓均質機進行均質，均質完成后得到乳狀液。

1.3.2 乳狀液穩(wěn)定性的測定1.3.2.1 透射光濁度法

在時間/外力作用下，乳狀液液滴大小發(fā)生變化，光的透過率也會隨之發(fā)生變化，以此來衡量乳狀液的穩(wěn)定性。采用0.2 mol/L的重鉻酸鉀溶液作為參照，利用紫外可見分光光度計在固定波長下，選取已制備的乳狀液，測定其透光度t的變化來確定乳狀液的穩(wěn)定性，則乳狀液穩(wěn)定性參數(ESIt)如式(1)所示。

(1)

1.3.2.2 電導率法

在25 ℃下，利用電導率儀測量乳狀液的電導率κ。則乳狀液穩(wěn)定性參數如式(2)所示。

(2)

1.3.3 掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscope, SEM)觀察

在掃描電子顯微鏡樣品臺上貼上一層雙面膠，將少許微膠囊產品撒在雙面膠上，吹去多余的粉末，樣品噴金，加速電壓為15 kV。在觀察過程中盡量縮短時間，避免電子束造成的微膠囊產品損傷。

1.3.4 表面張力測定

量取一定體積的乳狀液，在室溫條件下，放置于表面張力儀的玻璃皿中，測定其表面張力值。

1.3.5 油脂過氧化值(POV)的測定

1.3.5.1 微膠囊中油脂的提取

準確稱取10 g微膠囊樣品置于500 mL 具塞三角瓶中，加入50 mL蒸餾水，攪拌溶解；加入50 mL乙醇，30 mL乙醚以及30 mL石油醚，振蕩2 min，轉入分液漏斗，靜置分層；取下層液體，用20 mL石油醚萃取2次，合并濾液，轉移至已恒重的250 mL圓底燒瓶中；使用旋轉蒸發(fā)儀45 ℃下蒸干，得到即為微膠囊中的油脂。

1.3.5.2 過氧化值的測定

參考國標法GB/T 5009.37—2003。將破壁提取的油脂(mL)置于250 mL碘瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰醋酸(2∶3)混合液，使得試樣完全溶解；加入1 mL飽和碘化鉀溶液，緊密塞好瓶蓋，并輕輕振搖0.5 min，然后在暗處放置3 min；取出后加入100 mL水，搖勻，立即用硫代硫酸鈉標準滴定溶液滴定，至淡黃色時，加1 mL淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失為終點；在同樣條件下用水和Na2S2O3標準滴定溶液做空白實驗，試樣過氧化值POV按式(3)計算。

(3)

式中：POV為試樣的過氧化值/mmol/kg；V1為試樣消耗硫代硫酸鈉標準滴定溶液體積/mL；V2為試劑空白消耗硫代硫酸鈉標準滴定溶液體/mL；c為硫代硫酸鈉標準滴定溶液的濃度/mol/L；0.126 9為與1.00 mL硫代硫酸鈉標準滴定溶液[c(Na2S2O3)=1.000 mol/L]相當的碘的質量/g；39.4為換算因子。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 預乳化時間

液滴的膜越薄，其吉布斯彈性值越高。當吉布斯彈性值達到一定程度時，液滴的排液才受阻礙，有利于乳狀液的形成。由于膜延伸和表面活性劑的存在，液膜中最薄部分將有最高的吉布斯彈性值，對延伸阻力最大[23]。因此，界面張力梯度對乳狀液的形成很重要。液滴在界面膜以較低速度被拉伸時形成比較容易，因此在初始乳化階段，攪動的速度越慢越有利。高壓均質制備乳狀液之前，需采用較低速率的膠體磨進行預乳化。

實驗室用膠體磨轉速約6 000 r/min，破碎粒度3～20 μm，其通過電機帶動轉齒，與相配的定齒做相對高速旋轉。被加工的物料通過本身的重量和旋轉，產生螺旋向下的沖擊作用力，在定、轉齒間隙間的如剪切力、摩擦力和高頻振動等強大作用力下，物料被有效的乳化、分散、破碎，從而使物料得到超細粉碎及較好乳化。由于膠體磨的破碎強度小于高壓均質機，故使用其為高壓均質工序制備乳狀液提供預乳化液，相當于預乳化階段，其時間長短影響加工得到的乳狀液穩(wěn)定性。

圖1 預乳化時間對乳狀液穩(wěn)定性的影響

如圖1所示，使用膠體磨加工物料的時間，即預乳化時間對后續(xù)得到的乳狀液穩(wěn)定性有較為明顯的影響。采用兩種方式評價乳狀液的穩(wěn)定性，其變化趨勢基本相同。隨著預乳化時間的增長，乳狀液的穩(wěn)定性顯著提高。預乳化時間超過2 min后，制備得到的乳狀液穩(wěn)定性基本沒有差異。預乳化時間需合理選擇，防止時間過長導致芯材受外界環(huán)境影響而發(fā)生變質。

2.1.2 乳化溫度

乳化溫度對乳狀液穩(wěn)定性的影響見圖2，隨著溫度的增加，乳狀液穩(wěn)定性可以得到顯著提高。當乳化溫度從30 ℃上升到40 ℃時，ESIt從27.0%降低至5.2%，ESIκ從22.3%降低至18.0%，乳狀液穩(wěn)定性提升顯著。當從40 ℃上升到80 ℃時，ESIt從5.2%降低至4.0%，ESIκ從18.0%降低至16.0%?？梢?，溫度高于40 ℃后，溫度對乳狀液穩(wěn)定性基本沒有影響。

圖2 乳化溫度對乳狀液穩(wěn)定性的影響

溫度對乳狀液穩(wěn)定性的影響與壁材的溶解性緊密相關。在本研究中，采用OSA淀粉與麥芽糊精的復合材料做壁材。麥芽糊精可以完全溶解于水，故壁材的溶解性取決于OSA淀粉的溶解性。

OSA淀粉的溶解性良好[24]。淀粉通過溶脹和水合作用溶解在水中，淀粉的無定形區(qū)的直鏈淀粉聚集程度較弱，是溶解發(fā)生的主要區(qū)域[25]。此外，淀粉的無定形區(qū)容易發(fā)生酯化反應，酯化之后淀粉分子內加入了親水基團，使淀粉的親水性增強，造成更多的水分向淀粉顆粒內部滲透，增強淀粉顆粒的溶脹性[24]。

隨著乳化溫度的增加，OSA淀粉顆粒發(fā)生水合作用，溶脹加強，促使溶解在水中的OSA淀粉質量分數增加。提高了乳狀液的界面上的吸附量，界面層加厚，有利于乳狀液的穩(wěn)定。當乳化溫度提高到一定程度(40 ℃)，OSA淀粉的溶解度增加較小或不再增加，則制備形成的乳狀液的穩(wěn)定性基本不發(fā)生變化。但是溫度過高不僅會造成工藝成本的增加，而且會導致乳狀液中的DHA油脂受熱氧化變質。

2.1.3 均質壓力

采用高壓均質機對物料進行均質，其工作原理是以高壓為驅動力，利用往復泵為動力，把物料傳遞及輸送至工作閥(分為一級和二級均質閥)部分。通過工作閥時，待處理的物料被高壓下產生的強烈的撞擊、剪切和空穴作用粉碎、超微細化[26]。將均質壓力設置為10～50 MPa，其對乳狀液穩(wěn)定性的影響如圖3所示，通過兩種方式衡量乳狀液的穩(wěn)定性，其趨勢基本一致。

當均質壓力從10 MPa上升到20 MPa時，以透射光濁度為指標，ESIt從39.6%下降到7.3%，表明乳狀液穩(wěn)定性得到顯著提升。當均質壓力上升到40 MPa時， ESIt下降至1.8%，此時乳狀液最為穩(wěn)定。均質壓力提高對乳狀液穩(wěn)定性的影響與乳化體系的均一性密切相關。提高均質壓力，形成的液滴小而均勻，乳化體系的均一性提高，不易出現絮凝、聚結等破壞現象，從而有效的提高了乳狀液穩(wěn)定性[27]。而且乳狀液體系越均一穩(wěn)定，噴霧干燥微膠囊化時，油滴粒子從霧化液滴內部向表面遷移的幾率越低，噴霧干燥得到的微膠囊產品的品質越高。

均質壓力為50 MPa時，ESIt上升至6.2%，乳狀液穩(wěn)定性下降。這與均質壓力過高破壞了OSA淀粉的結構相關。通過非對稱垂直流流場分割(asymmetrical flow filed-flow fraction，AsFlFFF)和多角度激光散射法(a multi-angle light scattering detector，MALS)研究顯示，高壓均質產生的湍流湍動會造成OSA淀粉大分子結構的破壞，從而影響其對乳狀液體系的空間穩(wěn)定作用、靜電作用以及增稠作用[25, 28]。但是均質壓力越高，能耗越大，產生的熱能越大，影響芯材的質量，故選擇合適的均質壓力，對乳狀液的穩(wěn)定性有較大影響。

2.1.4 均質級數

高壓均質操作處理是為了使芯材與壁材能高度分散形成均一穩(wěn)定的乳化體系，以便于噴霧干燥微膠囊化操作。在乳狀液制備過程中，反復幾次高壓均質操作可促進其形成更為穩(wěn)定的乳狀液。設置均質壓力為15 MPa，均質級數對乳狀液穩(wěn)定性的影響如圖4所示，當高壓均質操作兩次時，對比沒有經過高壓均質的乳狀液，以透射光濁度衡量，ESIt從59.2%下降至5.0%，表明其穩(wěn)定性顯著提高。設定恒定的均質壓力，均質設備對物料的撞擊力、剪切力以及空穴作用保持恒定。增加一定的均質級數，液滴經過工作閥的次數增加，有利于形成均一穩(wěn)定的液滴，從而使得乳狀液體系的穩(wěn)定性增加。

圖4 均質級數對乳狀液穩(wěn)定性的影響

當均質級數達到4次時，乳狀液穩(wěn)定性參數值均有所上升，ESIt從3.9%提高到6.5%，ESIκ從15.6%提高到18.1%，表明乳狀液穩(wěn)定性下降。這是由于均質級數過多，壁材中的OSA淀粉結構遭到破壞，乳化能力下降。而且，均質壓力恒定，增加均質級數，能耗升高，產生的熱量增多，會影響DHA芯材性質，也會顯著影響乳狀液穩(wěn)定性。

2.2 DHA乳狀液制備工藝正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎上，選取乳化溫度、均質壓力、預乳化時間及均質次數作為自變量，以乳狀液穩(wěn)定性和表面張力為評價指標，設計L9(34)正交試驗，采用雙目標優(yōu)化，因素與水平見表1。正交實驗結果與方差分析分別見表2與表3。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表

由表2可知，在DHA乳狀液制備的過程中，對乳狀液穩(wěn)定性的影響因素依次是均質級數>預乳化時間>均質壓力>乳化溫度。由表3可知，均質級數、預乳化時間和均質壓力對乳狀液穩(wěn)定性的影響顯著。而影響乳狀液表面張力大小的各因素的主次關系為：均質級數>均質壓力>預乳化時間>乳化溫度。方差分析結果表明，均質壓力和均質級數對乳狀液穩(wěn)定性的影響顯著。

表2 DHA乳狀液制備的正交試驗設計與結果

表3 方差分析

乳狀液制備是噴霧干燥進行油脂微膠囊化的前提，其目的是制備高品質微膠囊產品，即高DHA包埋率、較低的表面油及浸出率。微膠囊技術的初衷即包埋DHA油脂，保護DHA免受光、熱、氧等外部環(huán)境的影響，避免其氧化變質。較高的均質壓力、較多的均質級數、較高的乳化溫度以及較長的預乳化時間均會提高DHA氧化變質的可能。但過于劇烈的制備條件易導致DHA油脂氧化變質。綜合考慮，選擇最優(yōu)均質壓力30 MPa，預乳化時間3 min，經過2級均質操作。雖然均質溫度對乳狀液穩(wěn)定性和表面張力均無顯著影響，但極差仍較大，結合正交試驗結果和單因素試驗結果綜合考慮，選擇乳化溫度 50 ℃。在此條件下制備得到DHA乳狀液，透射光濁度法測定得到乳狀液穩(wěn)定性為8.75%，表面張力為20.5 mN/m。乳狀液在較溫和的條件下，制備所得的乳狀液具有較好的穩(wěn)定性與表面張力，預期能有效的提高DHA微膠囊產品質量。

2.3 乳狀液制備微膠囊的氧化穩(wěn)定性

選擇優(yōu)化后的工藝(乳化溫度50 ℃、均質壓力30 MPa、預乳化時間3 min，2級均質)制備DHA乳狀液，制備后進行微膠囊包埋。作為對照，選擇未經微膠囊包埋的DHA油脂和未優(yōu)化乳狀液制備工藝的微膠囊。測定三種DHA油脂產品的過氧化值評價其氧化穩(wěn)定性，結果見圖5。

圖5 微膠囊化前后DHA微藻油的過氧化值(POV)

較高的油脂氧化穩(wěn)定性，即較低的過氧化值有利于延長DHA油脂微膠囊的貨架期[29]。從圖5可知，未經過微膠囊包埋的DHA微藻油的過氧化值為0.09 mmol/kg，略低于微膠囊包埋后油脂的過氧化值(0.20 mmol/kg和0.19 mmol/kg)。這是由于經過微膠囊化之后，未被包埋的表面油脂的表面積大大增加，微膠囊表面油快速氧化，導致其氧化穩(wěn)定性下降[30]。是否工藝優(yōu)化對初始DHA油脂的氧化穩(wěn)定性沒有顯著影響。在貯存初期(1 d)，所有樣品的過氧化值均有小幅上升，證明其氧化穩(wěn)定性降低。且未微膠囊化后油脂的過氧化值上升的更為明顯，貯藏1 d后的過氧化值提高至0.36 mmol/kg，氧化穩(wěn)定性低于微膠囊化后的DHA油脂。而經過乳狀液制備工藝優(yōu)化后DHA油脂的過氧化值上升幅度最小，貯藏1 d后的過氧化值為0.21 mmol/kg，氧化穩(wěn)定性高于其他兩種DHA油脂。經過3 d的貯藏后，DHA油脂的過氧化值均顯著上升，未微膠囊化的DHA油脂過氧化值從第3天的1.64 mmol/kg提高至第5天的4.38 mmol/kg，而經過微膠囊化后，DHA過氧化值在第5天不超過2.39 mmol/kg。這是由于微膠囊可以有效的防止氧氣的滲透，從而顯著減少了油脂的氧化。經過了7 d(168 h)的存儲后，利用優(yōu)化后工藝制備DHA乳狀液所得微膠囊的過氧化值為1.78 mmol/kg，顯著低于工藝優(yōu)化前的DHA油脂(3.16 mmol/kg)。可見，乳狀液的制備工藝經過優(yōu)化后，能夠有效的提高油脂的氧化穩(wěn)定性，延長DHA油脂的貯存期。

3 結論

本研究以DHA微藻油為研究對象，建立其在乳狀液制備過程中的最佳工藝條件為乳化溫度50 ℃、預乳化時間3 min、均質壓力30 MPa、經過2級均質。在此條件下制備得到DHA乳狀液，透射光濁度法測定得到乳狀液穩(wěn)定性為8.75%，表面張力為20.5 mN/m。乳狀液在較溫和的條件下，制備所得的乳狀液具有較好的穩(wěn)定性及較低的表面張力，預期有效的延長DHA微膠囊的保質期。

經過工藝優(yōu)化后制備所得的DHA乳狀液，在微膠囊化之后的貯藏穩(wěn)定性得到顯著提高。經過較長時間貯藏之后，其過氧化值顯著低于對比未工藝優(yōu)化和工藝優(yōu)化但未微膠囊包埋的DHA油脂，表明其氧化穩(wěn)定性得到顯著提高。