王 靜 陳 晨 李楠楠 賈才華 趙思明張賓佳 牛 猛 熊善柏 林親錄

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，武漢 430070) (中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，長沙 410004)

傳統(tǒng)食物發(fā)酵過程可使食物產(chǎn)生特有的風(fēng)味，且原材料中的大分子物質(zhì)可被降解為易于人體吸收的營養(yǎng)成分，提升食物的生物利用率，因而發(fā)酵食物備受人們的青睞[1]。不同微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶系存在差異，復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的種類、含量較單一發(fā)酵的高[2, 3]。已有研究報道，采用復(fù)合發(fā)酵制作的饅頭風(fēng)味物質(zhì)種類多且含量高[4]；利用米根霉和少孢根霉復(fù)合發(fā)酵豆渣可以提高豆渣營養(yǎng)成分并增強其抗氧化活性[5]。

米發(fā)糕是中國南方傳統(tǒng)的大米發(fā)酵制品，常采用酵母菌、乳酸菌和霉菌等微生物發(fā)酵制作米發(fā)糕，不同發(fā)酵微生物使得米發(fā)糕在感官品質(zhì)和營養(yǎng)特性方面存在差異[6, 7]。且已有研究報道，利用蛋白酶水解大米蛋白分析鑒定得大米抗氧化肽[8]。而在米發(fā)糕發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的蛋白酶會對大米蛋白進行水解，可釋放活性肽。此外，胃腸消化過程中蛋白質(zhì)、多肽在胃蛋白酶、胰蛋白酶的作用下可進一步被水解或修飾，暴露出更多的活性基團[9, 10]。因此，研究胃腸水解條件下米發(fā)糕的健康效應(yīng)具有重要意義。本實驗采用凝膠層析色譜、超濾膜分離及液相色譜-四級桿飛行時間(TOF LC/MS/MS)質(zhì)譜技術(shù)，通過Fe2+螯合能力和還原能力評價米發(fā)糕體外胃腸水解物的抗氧化活性，探究不同發(fā)酵劑制備米發(fā)糕的水提物和胃腸水解物中肽段差異性與抗氧化性的關(guān)系，為米發(fā)糕的營養(yǎng)健康特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

秈米粉(粉狀)、安琪耐高糖活性干酵母和甜酒曲(甜味型)；卡斯特酒香酵母ZSM-001、米根霉ZSM-003：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程系從米發(fā)糕泥漿中分離篩選獲得[11]。

1.2 主要試劑

葡聚糖凝膠G-25、DPPH、胰蛋白酶(4 000U/mg蛋白)、菲咯嗪、胃蛋白酶(3 000 U/mg蛋白)、甲酸(色譜純)、氯化亞鐵、氯化鐵、鐵氰化鉀、雙氧水、硫酸亞鐵、三氯乙酸。未標(biāo)注試劑均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(HHS)，離心機(TDL-5A)，凝膠層析柱(Sephadex G-25)，可見光光度計(722N型)，真空冷凍干燥機(FD-1A-50型)，半制備液相色譜儀(Agilent 1260)，TechMate C18色譜柱(ST C18 4.6 mm×150 mm)，AB Sciex TOF LC/MS/MS(TripleTOF 5 600+)。

1.4 方法

1.4.1 米發(fā)糕的制備

米發(fā)糕的制備采用文獻[12]報道的方法，以秈米粉為原料，3種發(fā)酵劑為輔料，加入純凈水?dāng)嚢杈鶆颍?5 ℃發(fā)酵12 h后，注模蒸制而成3種不同的米發(fā)糕。其中3種發(fā)酵劑分別為發(fā)酵劑1、發(fā)酵劑2和發(fā)酵劑3。

1.4.2 水提物制備

搗碎的米發(fā)糕與去離子水以1∶5比例混合，適度攪拌后在37 ℃水浴提取4 h后，置于沸水浴中10 min，待冷卻后，4 000 r/min離心20 min，過濾，取上清液，冷凍干燥，即得水提物。

1.4.3 胃腸水解物制備

胃腸水解物的制備參考文獻[13]的方法，并有所修改。搗碎的米發(fā)糕與去離子水以1∶5比例混合，用1.0 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)體系pH至2，加入胃蛋白酶(添加量為米發(fā)糕蛋白質(zhì)量的4%)，適度攪拌后37 ℃恒溫2 h，恒溫結(jié)束后，1.0 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至7.0，然后加入胰蛋白酶(添加量為米發(fā)糕蛋白質(zhì)量的4%)，適度攪拌后37 ℃恒溫2 h，恒溫結(jié)束后，置于沸水浴中10 min滅酶，冷卻，4 000 r/min離心20 min，取上清液，冷凍干燥，即得米發(fā)糕胃腸水解物。米發(fā)糕蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5—2010，得到菌株ZSM-001制備的米發(fā)糕(J)、菌株ZSM-001與ZSM-003制備的米發(fā)糕(JG)和安琪酵母與酒曲制備的米發(fā)糕(AJ)的蛋白含量分別為(6.31±0.01)、(6.42±0.07)、(6.34±0.06) g/100 g。

1.4.4 分子質(zhì)量分布測定

樣品分離時，加入1 mL濃度為20 mg/mL的樣品，以0.4 mL/min的流速洗脫，記錄儀記錄下流出液流出情況，用10 mL離心管收集流出液體，并于280 nm測定吸光值，記錄各物質(zhì)出現(xiàn)最大吸收峰的時間及吸光值大小。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，分別取L-酪氨酸(181.19 u)、還原型谷胱甘肽(307.33 u)、VB12(1 355.38 u)、溶菌酶(14 400 u)和牛血清蛋白(67 000 u)各20 mg溶于1 mL洗脫液中，得到20 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述操作加入1 mL進行分析，以最大吸收峰的出峰時間和標(biāo)品的分子質(zhì)量對數(shù)繪制標(biāo)曲[14, 15]。經(jīng)過葡聚糖G-25凝膠層析色譜柱，洗脫時間分別為375、345、285、225和120 min，以分子質(zhì)量的對數(shù)(lgM)為縱坐標(biāo)，出峰時間T為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其直線方程為y=-0.010 6x+6.244 5(R2=0.973 3)，以此估算水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布范圍，為抗氧化肽進一步分離提供信息。

1.4.5 超濾

根據(jù)分子質(zhì)量測定結(jié)果，選用3 ku、10 ku的超濾膜，將樣品液分離為3個組分(Ⅰ>10 ku、Ⅱ3～10 ku、Ⅲ<3 ku)，收集3個超濾組分，冷凍干燥，用于抗氧化活性測定。

1.4.6 抗氧化活性測定

將樣品分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10、20、40、60、80、100 mg/mL的溶液，測定米發(fā)糕超濾組分的抗氧化活性。

1.4.6.1 Fe2+螯合能力

Fe2+螯合能力的測定按照文獻[16]報道的方法，并略作修改。取1 mL的樣品溶液，加入3.7 mL乙醇和0.1 mL 2 mmol/L的氯化亞鐵溶液混合，混勻后加入0.2 mL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液啟動反應(yīng)。室溫靜置10 min后，測定溶液在562 nm波長處檢測吸光值。

Fe2+螯合能力=(A0-A1)/A0×100%

式中：A0為空白吸光值，A1為樣品吸光值。

1.4.6.2 還原能力的測定

還原能力的測定按照文獻[17]報道的方法，并稍作調(diào)整。取多肽溶液1 mL，加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混合以后，在50 ℃下，保溫20 min后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸。經(jīng)充分混合后以3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1% 氯化鐵，混勻后，測定反應(yīng)液在700 nm處的吸光度值。

1.4.7 米發(fā)糕消化前后水解物質(zhì)譜分析

使用TOF LC/MS/MS檢測米發(fā)糕水提物和胃腸水解物中小于3 ku的組分[17]。將樣液上樣到C18捕獲柱(5 μm，5 mm× 0.3 mm，Agilent Technologies)上，然后洗脫到C18分析柱(75 μm×150 mm，3 μm粒徑，孔徑100 ?，Eksigent)中。

使用流動相A(3%DMSO，97%H2O，0.1%甲酸)和流動相B(3%DMSO，97%ACN，0.1%甲酸)，洗脫程序為：0～15 min，5%B；15～35 min，5%B～35%B；35～36 min，35%B～80%B；36～41 min，80%B；41～41.1 min，80%B～5%B；41.1～50 min，5%B。恒定流量為0.3 mL/min。MS掃描從350到1 500 m/z進行，時間跨度為250 ms。MS/MS分析，每個掃描周期由一個全掃描質(zhì)譜(m/z：350～1 500，電荷狀態(tài)：2～5)組成，隨后是40個MS / MS事件。使用ProteinPilot軟件分析來自TripleTOF 5 600+的原始數(shù)據(jù)。使用以下參數(shù)在UniProt(Rice indica)參考數(shù)據(jù)庫中搜索數(shù)據(jù)：樣品類型，鑒定；Cys烷基化，無；消化，無。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每次實驗重復(fù)3次，取平均值，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 米發(fā)糕水提物和胃腸水解物的分子質(zhì)量分布

將米發(fā)糕水提物和胃腸水解物的凝膠色譜圖(圖1)統(tǒng)計成表1，由表1可知，不同微生物發(fā)酵制成的米發(fā)糕，其水提物和胃腸水解物的分子質(zhì)量分布差異較大。JGs、AJs的分子質(zhì)量主要集中在3 ku以下，分別為64.14%、70.29%，Js的分子質(zhì)量主要集中在>10 ku(41.52%)和<3 ku(43.64%)。由于復(fù)合發(fā)酵對米發(fā)糕中的蛋白質(zhì)水解能力強于酵母菌單獨發(fā)酵水解能力，復(fù)合發(fā)酵劑使得米發(fā)糕中小分子多肽、游離氨基酸較多[18]。經(jīng)胃腸水解后，Jw、JGw、AJw米發(fā)糕胃腸水解物的分子質(zhì)量減小，集中在<3 ku，分別占到總含量的69.41%、74%、71.11%。結(jié)果表明，米發(fā)糕在胃蛋白酶、胰蛋白酶作用下，蛋白質(zhì)和多肽進一步降解，產(chǎn)生更多小分子肽和游離氨基酸。有研究報道分子質(zhì)量越小的物質(zhì)，穿過腸道屏障并發(fā)揮生物效應(yīng)的可能性越高[19, 20]。因此，米發(fā)糕胃腸水解物中含有抗氧化活性的小分子肽，可能穿過腸道屏障并發(fā)揮抗氧化性，提升米發(fā)糕功能性。同時，分子質(zhì)量分布情況也為后續(xù)實驗超濾膜的選擇提供依據(jù)。

表1 不同種類米發(fā)糕水提物和胃腸水解物的分子質(zhì)量分布

2.2 米發(fā)糕胃腸水解物超濾組分抗氧化活性

過渡金屬離子可催化加快自由基產(chǎn)生，促進氧化反應(yīng)的發(fā)生，可導(dǎo)致油脂氧化加速和人體自由基產(chǎn)生能力大于機體清除能力，因此螯合金屬可間接反應(yīng)物質(zhì)的抗氧化活性[21]。物質(zhì)的抗氧化能力與還原能力也密切相關(guān)，還原能力越強，抗氧化能力越強[21]?；趯嶒炇仪捌谘芯?，已發(fā)現(xiàn)米發(fā)糕水提物和胃腸水解物均具有一定抗氧化性，其Fe2+螯合能力和還原能力分別與0.001～0.006 mg/mL EDTA溶液和0.01～0.06 mg/mLVc溶液相當(dāng)，且胃腸水解物的抗氧化性較水提物的抗氧化性高[22]。米發(fā)糕胃腸水解物的超濾組分抗氧化能力由圖2可知，質(zhì)量濃度在10～100 mg/mL范圍內(nèi)時，F(xiàn)e2+螯合能力、還原能力與濃度之間都呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。3種米發(fā)糕胃腸水解物呈現(xiàn)出分子質(zhì)量越小，F(xiàn)e2+螯合能力越強的趨勢，其中AJw-Ⅲ最大，其次為JGw-Ⅲ。Jw-Ⅲ、AJ w-Ⅲ的還原能力強于組分Ⅱ和組分Ⅰ，而JGw-Ⅰ的還原能力強于JGw-Ⅲ和JGw-Ⅱ。整體而言，分子質(zhì)量<3 ku的組分表現(xiàn)出較好的抗氧化性，且AJw的抗氧化活性較高。肽的抗氧化性與其分子質(zhì)量大小密切相關(guān)，具有抗氧化性的多肽片段分子質(zhì)量一般<3 ku[23, 24]。米發(fā)糕胃腸水解物表現(xiàn)出一定的Fe2+螯合能力，可能是由于蛋白質(zhì)、多肽的水解導(dǎo)致鐵離子與其側(cè)鏈上的氨基和羧基結(jié)合[25]。此外，較高的還原能力表明水解肽具有供電子能力的基團，這些肽只有在適當(dāng)?shù)姆肿淤|(zhì)量，供電子基團才能得到充分暴露發(fā)揮抗氧化作用[24, 26]。

2.3 總離子流圖譜差異

將米發(fā)糕水提物和胃腸水解物的超濾組分Ⅲ進行抗氧化肽差異性研究，用TOF LC/MS/MS質(zhì)譜儀鑒定。由總離子流圖3可知，三種米發(fā)糕水提物和胃腸水解物中的肽段存在顯著性差異。JGs-Ⅲ總離子流圖洗脫峰范圍出現(xiàn)較廣，肽段數(shù)量較多，主要集中在10～60 min，Js-Ⅲ、AJs-Ⅲ洗脫峰主要集中在10～40 min，出峰較早，說明肽段極性較大。胃腸水解物的超濾組分Ⅲ的肽段數(shù)量顯著增多，洗脫峰主要集中在10～70 min。JGw-Ⅲ、AJw-Ⅲ出峰較晚，強度較高的肽段集中在30～60 min出現(xiàn)，說明肽段疏水性較強。有研究報道蛋白質(zhì)被水解成更小的肽段使更多的疏水基團暴露，而有利于提高抗氧化活性[14, 27]?；诳寡趸钚栽u價結(jié)果，推測復(fù)合微生物發(fā)酵制備的米發(fā)糕(JG、AJ)的抗氧化活性與其在胃腸水解中暴露出更多的疏水基團密切相關(guān)。

2.4 肽段數(shù)的差異性

將TOF LC/MS/MS鑒定到的肽段在Uniprot數(shù)據(jù)庫搜索比對，得到米發(fā)糕水提物和胃腸水解物的超濾組分Ⅲ的肽段序列。將肽段進行統(tǒng)計分析可得米發(fā)糕肽段數(shù)分布情況(圖4)，JGs的肽段最多，檢測到1 799個肽段，其次是Js(368個)、AJs(310個)。表明酵母ZSM-001與米根霉ZSM-003復(fù)合發(fā)酵對米發(fā)糕中蛋白質(zhì)的酶解作用較強，產(chǎn)生較多肽段。經(jīng)胃腸水解后，AJw和Jw可檢測到的肽段數(shù)相比其水提物的肽段數(shù)明顯增加，其中AJw肽段總數(shù)最高(1 148個)，而JGw肽段數(shù)相對減少，可能由于JG中多肽降解為分子質(zhì)量較小的氨基酸，儀器無法檢測。說明胃蛋白酶和胰蛋白酶促進蛋白質(zhì)、多肽進一步水解，產(chǎn)生更多小肽，暴露出更多抗氧化活性基團，提升了米發(fā)糕胃腸水解物的抗氧化性。其中安琪酵母和甜酒曲復(fù)合發(fā)酵制備的米發(fā)糕(AJ)，由抗氧化活性評價結(jié)果可知，其胃腸水解物的Fe2+螯合能力最大，還原能力較高，推測可能是AJ在胃腸水解過程產(chǎn)生更多的抗氧化肽。

圖4 米發(fā)糕水提物和胃腸水解物中肽段數(shù)總數(shù)

3 結(jié)論

米發(fā)糕經(jīng)胃腸水解后，其抗氧化活性提高，分子質(zhì)量集中在3 ku以下，并且分子質(zhì)量小于3 ku組分的抗氧化能力高。通過TOF LC/MS/MS總離子流圖分析，確是米發(fā)糕胃腸水解物中肽段疏水性越強其抗氧化活性越強。不同發(fā)酵劑導(dǎo)致米發(fā)糕在胃腸水解中產(chǎn)生多肽的能力存在差異，復(fù)合發(fā)酵菌株水解蛋白質(zhì)的能力較強，產(chǎn)生較多小分子肽。以安琪酵母與酒曲復(fù)合發(fā)酵制作的米發(fā)糕在胃腸水解后，胃腸水解物中分子質(zhì)量小于3 ku組分的肽段數(shù)最多，疏水性較強，F(xiàn)e2+螯合能力最大，還原能力較高。