肖金玲 沈 蒙 葛云飛 康子悅 王 娟全志剛 王維浩,2 刁靜靜,2 曹龍奎,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)

綠豆(Mung bean)，又稱青小豆、菉豆、植豆等，是菜豆族豇豆屬的一個植物栽培種[1]，廣泛分布于世界各個地區(qū)。據(jù)《本草綱目》記載，綠豆具有清熱除濕、解毒、利水等功效，屬醫(yī)食同源作物，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、釀造工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等[2]。綠豆中不僅含有人體所必需的營養(yǎng)素，還含有許多生物活性成分，如單寧、香豆素、生物堿、皂甙和植物甾醇等[3]，這些活性物質(zhì)與綠豆的藥理功能密切相關(guān)。萌芽可使種子中貯藏的次生代謝產(chǎn)物發(fā)生復(fù)雜的合成、代謝及轉(zhuǎn)化反應(yīng)[4]，發(fā)芽時由于酶的作用，活性成分得到釋放，更利于人體吸收[5]。由于酶的種類增加、活性增強，導(dǎo)致呼吸作用加強[6,7]，異黃酮、總酚酸等含量增加[8，9]。

多酚類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、預(yù)防或減少疾病的發(fā)生等功效。研究表明豆類植物是酚類的重要來源，酚類化合物可以保護體內(nèi)生物大分子免受氧化的損傷，具有較強的抗氧化活性[10,11]。目前國內(nèi)針對綠豆萌發(fā)前后多酚含量、種類、抗氧化能力及相關(guān)代謝通路等問題的比較報道較少，且不夠全面。因此，對綠豆芽中多酚類化合物進行系統(tǒng)性分析意義重大。

本研究以自然萌發(fā)綠豆為基礎(chǔ)，采用超聲-微波協(xié)同萃取法提取綠豆多酚類化合物，結(jié)合植物廣靶代謝組學(xué)定性定量分析萌發(fā)前后的綠豆多酚類物質(zhì)代謝變化及差異性，并尋找相關(guān)代謝通路，并對萌發(fā)前后多酚含量及抗氧化能力加以分析，為拓寬綠豆中多酚類化合物的應(yīng)用及開發(fā)綠豆芽市場等方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 實驗材料

明綠豆、Folin試劑、沒食子酸、石油醚分析純級別、無水碳酸鈉、總抗氧化試劑盒、1-二苯基-2-苦基肼自由基、甲醇和乙腈均為HPLC級別、甲酸。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CW-2000A 超聲-微波協(xié)同萃取/反應(yīng)儀，F(xiàn)reeZone 2.5L 真空冷凍干燥機，MJ-10A 高速萬能粉碎機，Specord 210 plus 紫外可見分光光度計，XCIEX AD 超高效液相色譜，Triple TOF 6600 高分辨質(zhì)譜，Agilent 6490 Series 三重四極桿質(zhì)譜，UPLC HSS T3色譜柱 (1.8 μm, 2.1 mm×100 mm)，D24 UV 純水儀，Heraeus Fresco17 離心機，TD5A-WS 臺式離心機，HJ25-SCT-02型索氏提取器。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 原料預(yù)處理

綠豆→稱取→粉碎→脫脂→脫脂綠豆粉→備用

綠豆→選取→去離子水清洗→0.4% KMnO4殺菌→去離子水清洗3次→萌發(fā)處理→預(yù)冷凍→凍干→粉碎→脫脂→脫脂綠豆芽粉→備用

1.2.1.2 樣品多酚的提取

采用超聲-微波(U-M)協(xié)同萃取樣品多酚[12]。稱取2 g樣品放入150 mL容量瓶中，按照料液比1：20、乙醇溶液體積分數(shù)60%、U-M協(xié)同處理時間30 min、U-M協(xié)同處理溫度45 ℃，提取2次，合并提取液離心，留取上清液備用。

1.2.1.3 多酚含量的檢測

采用Folin-Ciocalteu[13]法，稱取(10±0.01) mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加水定容至100 mL容量瓶中，得0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，加入1 mL福林酚試劑，搖勻后加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為12%的 Na2CO3溶液，加水定容，搖勻。重復(fù)步驟，制作3組平行樣。室溫避光靜置2 h，760 nm處測吸光度。以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

吸取1 mL樣品于容量瓶中，加入1 mL福林酚試劑，搖勻加入2 mL 12%的Na2CO3溶液，加蒸餾水定容至100 mL，室溫避光靜置2 h，760 nm處測定吸光度。進行3次平行實驗，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總多酚含量，取平均值。

式中：M為總多酚含量/mg/g；A1為沒食子酸濃度/μg/mL；V為定容后積/mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.2.2 植物廣靶代謝組學(xué)分析

1.2.2.1 代謝物提取[14,15]

將6 mL樣品用N2吹干，加入300 μL溶劑進行復(fù)溶(甲醇水，體積比2∶1)，樣品在4 ℃條件下以13 000 r/min離心15 min。取上清液放入2 mL進樣瓶，每個樣品各取等體積混合成質(zhì)控樣品(Quality control，QC)，QC樣品以衡量系統(tǒng)的穩(wěn)定性，進行UHPLC-MS分析。

1.2.2.2 0.1%甲酸的配制

精密吸取0.5 mL甲酸至500 mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 超高效液相色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC，HSS T3 1.8 μm, 2.1 mm×100 mm，流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫條件為：0～10 min，2%～60%A；10～12 min，60%～98%A；12～13 min，98%A；13～13.1 min，98%～2%A；13.1～14 min，2%A；14～15 min，2%A；15 min，2%A。體積流量為0.4 mL/min，進樣室溫度15 ℃，柱溫35 ℃，進樣量2 μL。

1.2.2.4 質(zhì)譜條件[16,17]

使用裝備AJS-ESI離子源的Agilent 6490三重四極桿質(zhì)譜儀，以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行質(zhì)譜分析。參數(shù)為：毛細管電壓+3 500 V/-3 000 V，氣體(N2)溫度 220 ℃，氣體(N2)流量 16 L/min，鞘層氣體(N2)溫度 350 ℃，鞘層氣體流量 12 L/min，霧化器 40 psi。

數(shù)據(jù)采集時按mass range進行分段，50～300、290～600、590～900、890～1 500，從而擴大二級譜圖的采集率。每個方法每段采集4個重復(fù)。所采集獲得的數(shù)據(jù)，分別使用BiotreeDB數(shù)據(jù)庫及MAPS軟件進行數(shù)據(jù)分析。將母離子與二級譜中的子離子組合成離子對建成MRM數(shù)據(jù)庫。然后再在三重四極桿質(zhì)譜儀上對所有樣品進行MRM數(shù)據(jù)采集。

1.2.3 綠豆多酚體外抗氧化活性分析

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力

取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，無水乙醇定容至250 mL容量瓶，備用。Ai：3 mL樣品，3 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻；Aj：3 mL樣品，3 mL無水乙醇混勻；A0：3 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，3 mL無水乙醇混勻；均靜置70 min，510 nm處測吸光度值，按公式進行計算，取平均值。

式中：S為DPPH自由基清除率/%；Ai為樣品吸光值；Aj為本底吸光值；A0為空白吸光值。

1.2.3.2 總抗氧化能力檢測

采用總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒測定。準(zhǔn)確吸取待測樣品0.5 mL放入樣品管中，加入3.5 mL混合試劑(試劑一、試劑二、試劑三以體積比1∶2∶0.5 比例添加混合)，對照管中只加入3.5 mL混合試劑，迅速放入37 ℃恒溫水浴鍋中，水浴30 min后取出，在樣品管和對照管中分別加入試劑四0.2 mL，混勻后在對照各管中補加入待測樣品0.5 mL，最后在樣品管和對照管中分別加入0.2 mL試劑五，充分混勻后，室溫放置10 min，于520 nm處測量各管吸光度值。按公式進行計算，取平均值。

式中：T為總抗氧化能力/U/mL；OD測量為樣品管中待測樣品吸光度值；OD對照為對照管中待測樣品吸光度值；V反為反應(yīng)液總體積/mL；V取為樣品取樣量/mL；A為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010，繪圖用Origin，方差分析用SPSS。植物代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析[18,19]用MAPS軟件，并對數(shù)據(jù)進行總峰面積進行歸一化處理。使用MEV4.9.0軟件繪制差異代謝物層次聚類分析熱力圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

多酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.088 2x+0.005 7，R2=0.999 1，具有較好的線性關(guān)系。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 多酚(以沒食子酸當(dāng)量計)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 主成分分析圖

圖2為綠豆與綠豆芽主成分分析散點圖。QC樣本重合度較高，說明實驗方法穩(wěn)定性強、數(shù)據(jù)質(zhì)量高。綠豆與綠豆芽得到了明顯的區(qū)分，表明萌發(fā)前后綠豆中所含的化學(xué)成分差異顯著，所建立方法可以良好表征萌發(fā)前后的成分差異?？梢钥闯雒劝l(fā)前后被t [1]軸區(qū)分明顯，ld位于負半軸，ly位于正半軸。

注：ld為綠豆多酚，ly為綠豆芽多酚。圖2 PCA得分圖

表1為萌發(fā)前后部分綠豆多酚類化合物的組成成分定性定量表，UHPLC-MS/MS分析樣本中檢測到超過40種相對較多的多酚類物質(zhì)，根據(jù)其保留時間、文獻數(shù)據(jù)準(zhǔn)分子離子精確m/z和功能片段鑒定得出結(jié)果。其中萌發(fā)前響應(yīng)最高的前10種多酚類物質(zhì)為芹黃春、葒草苷、二氫槲皮素、3-羥基酪胺、表兒茶素、異櫻花苷、香葉木苷、蘆丁、香葉木素、(-)-表沒食子兒茶素，萌發(fā)后響應(yīng)最高的前10種多酚類物質(zhì)為芹黃春、大豆酚內(nèi)酯、香橙素、蘆丁、2，4，5，7-四羥基異黃烷酮、香豆雌酚、異槲皮苷、柚皮素、黃豆苷元、葒草素。此結(jié)果與董銀卯[20]在綠豆中篩選出的的12種酚酸及6種黃酮類成分相比更為系統(tǒng)和全面。檢測到的酚類化合物大部分都涉及到各種常見疾病的研究，如癌癥、抑菌、心肌損傷等[21-25]。

圖3為綠豆與綠豆芽差異代謝物層次聚類分析熱力圖，將代謝物相對含量進行聚類，高低表達交互在一起，紅色為高表達代謝物，綠色為低表達代謝物。其中根據(jù)顏色變化差異判斷出各組分表達的顯著性差異與表1結(jié)果相似，即調(diào)控極顯著(P<0.01)的物質(zhì)有根皮苷、黃豆苷、印度黃檀苷、柚皮苷、甘草甙、香葉木素、大豆酚內(nèi)脂、2-羥基肉桂酸、櫻黃素、二氫山柰酚、黃豆苷元、鷹嘴豆芽素A、黃豆黃素、山柰酚、(+-)-2，4，5，7，-四羥基異黃烷酮、香豆雌酚、新桔皮苷上調(diào)極顯著；(-)-表兒茶素、表兒茶素下調(diào)極顯著。調(diào)控顯著(P<0.05)的物質(zhì)有槲皮苷、異槲皮苷、染料木素、麥黃酮、二氫辣椒素酯、姜辣素對苯二酚、芥子酸、4-羥基肉桂酸、間羥基肉桂酸、松屬素、間羥基肉桂酸、松屬素上調(diào)顯著；3-羥基酪胺、二氫槲皮素、葒草苷、香葉木素、丁子香酚下調(diào)顯著。通過顏色深淺差異可知，綠豆中多酚經(jīng)過萌發(fā)處理后作為綠豆芽多酚大部分組分均上調(diào)且明顯，這表明萌發(fā)處理后，多酚含量變化顯著。

表1 綠豆與綠豆芽中多酚類化合物組成成分

注：A為綠豆多酚, B為綠豆芽多酚。圖3 差異代謝物層次聚類分析熱力圖

2.3 綠豆多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

由圖4可知綠豆多酚含量與清除DPPH自由基能力、總抗氧化能力在0.01水平上顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.988 1和0.910 2。這與杜雙奎等[26，27]的研究結(jié)果相近。其相關(guān)系數(shù)均大于0.75，證明綠豆多酚含量與DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力之間具有良好的正相關(guān)性，可用多酚含量的變化來解釋活性的變化情況。

2.4 綠豆及綠豆芽抗氧化能力的測定

綠豆多酚及綠豆芽多酚DPPH自由基清除能力及總抗氧化能力分別為87.94%、92.64%和28.52 U/mL、33.06 U/mL，萌發(fā)處理后多酚清除DPPH能力上升了5.07%?？偪寡趸芰ι吡?.54 U/mL。這與梁雅芹[28]研究的在萌發(fā)過程中綠豆酚類物質(zhì)及抗氧化活性變化的結(jié)果相似。而抗氧化能力上升的原因是萌發(fā)過程中發(fā)生酶激活作用，大量種皮上的酚類化合物被溶出，提高了多酚的提取含量。由于綠豆中抗氧化成分比較多，除多酚物質(zhì)外，還存在水溶性維生素E、維生素C等抗氧化成分，這些物質(zhì)也會在萌發(fā)過程中被激發(fā)出來，進而被抗氧化試劑盒測出。

圖4 綠豆多酚含量與清除DPPH自由基及總抗氧化能力的關(guān)系

表2是通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes，KEGG)注釋分析得到差異代謝物參與的通路，涉及到20種代謝通路的差異代謝，其中芹黃春、黃豆苷、柚皮苷、金圣草黃、櫻黃素、松屬素及新桔皮苷只參與1種代謝通路，其他多酚組分均參與2種以上代謝通路，甲氧基肉桂酸參與的代謝通路高達9種，說明這些酚類物質(zhì)存在于比較復(fù)雜的代謝通路中。

3 結(jié)論

本實驗將植物廣靶代謝組學(xué)方法應(yīng)用于綠豆萌發(fā)前后多酚類化合物成分改變的研究，分析鑒定出綠豆中存在多酚類化合物46種，檢測出萌發(fā)后提取液抗氧化能力增強，且多酚含量與抗氧化能力呈線性關(guān)系，并通過KEGG分析得到了20個代謝通路。在定性出的46種多酚類物質(zhì)中表兒茶素[29,30]、蘆丁[31,32]、咖啡酸[33]、黃豆黃素[34]、槲皮素[35,36]等研究較為廣泛，但間香豆酸、柚皮苷、二氫刺芒柄花素、印度黃檀苷、葒草素等物質(zhì)鮮有研究。萌發(fā)處理過程使綠豆中的部分高活性的多酚類物質(zhì)被激活，使其含量顯著增加，抗氧化能力進一步提升，說明萌發(fā)后部分多酚類物質(zhì)含量增高，成為抗氧化能力增強的主導(dǎo)因素，該結(jié)果為后續(xù)綠豆萌發(fā)處理提供可行性參考，也為綠豆的開發(fā)利用以及功能性食品的開發(fā)提供參考。后續(xù)研究可對綠豆中多酚類化合物進行分離純化，并進行定量分析，進一步分析萌發(fā)后哪種多酚類物質(zhì)主導(dǎo)使抗氧化活性增強，通過抑制某些代謝通路進行體內(nèi)體外實驗，獲得所需的效果。

表2 差異代謝物參與的代謝途徑