鐘政昌 張超奇 仁增白瑪蘭小中闞金濤袁 雷

(西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院1，林芝 860000) (西藏森林資源天然產(chǎn)物研究中心2，林芝 860000) (西藏農(nóng)牧學(xué)院理化分析與生物技術(shù)中心3，林芝 860000)

大花黃牡丹(Paeonialudlowii)于1997年確立其分類學(xué)上的名稱[1]，為毛茛科芍藥屬落葉花灌木, 黃牡丹的一個(gè)亞種，為西藏特有植物，僅分布在海拔2 900～3 200 m 的雅魯藏布江藏布峽谷長(zhǎng)約100 km的狹小范圍內(nèi)，是我國(guó)8個(gè)牡丹種之一[2-4]。李嘉玨等[2]經(jīng)調(diào)查研究認(rèn)為大花黃牡丹與黃牡丹存在較大差異，大花黃牡丹應(yīng)該上升為種的等級(jí)。大花黃牡丹分布區(qū)面積不足10 km2，數(shù)量?jī)H有6 000～7 000叢(株)，處于極度瀕危狀態(tài), 被《中國(guó)物種紅色名錄》收錄[5,6]。大花黃牡丹資源數(shù)量極少，研究主要集中在資源保護(hù)、擴(kuò)繁栽培等工作[7-11]。近十年來(lái)，西藏植物學(xué)和藏藥資源學(xué)工作者、地方政府、地方企業(yè)聯(lián)合大力推動(dòng)了大花黃牡丹擴(kuò)繁工作，未來(lái)其資源量有望大幅提高。開(kāi)展大花黃牡丹可持續(xù)性的開(kāi)發(fā)利用研究，對(duì)服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)及資源保護(hù)均有積極意義。

牡丹籽油富含α-亞麻酸,具有多種保健功能，近年掀起了研究熱潮[12-16]。2011年世界糧農(nóng)組織正式批準(zhǔn)牡丹籽油列入食用油行列, 同年, 我國(guó)原衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品, 2012年我國(guó)農(nóng)業(yè)部糧農(nóng)所把牡丹籽油列入食用油行列。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)牡丹籽油的研究主要為提取工藝、理化性質(zhì)評(píng)價(jià)、脂肪酸分析、部分功效評(píng)價(jià)、油脂熱變性等[17-21],對(duì)大花黃牡丹籽油的研究極少，曾秀麗等[22]對(duì)西藏林芝和山南地區(qū)5個(gè)居群的混合種子以及2個(gè)居群的單株進(jìn)行了5種脂肪酸含量分析，而大花黃牡丹籽含油量、提油技術(shù)、油脂品質(zhì)評(píng)價(jià)等方面鮮有報(bào)道。本研究根據(jù)GB/T 14488.1—2008測(cè)定大花黃牡丹籽含油量，建立提油技術(shù)并評(píng)價(jià)油脂品質(zhì)，為后期開(kāi)發(fā)利用西藏大花黃牡丹提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹籽采自西藏林芝縣、米林縣等地，經(jīng)蘭小中教授鑒定為西藏大花黃牡丹的種子；脂肪酸甲酯系列標(biāo)準(zhǔn)品、α、β、γ、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，石油醚、正己烷、氯仿、無(wú)水乙醚、氫氧化鉀、乙醇溶液、酚酞、鹽酸、韋氏試劑、碘化鉀、冰乙酸均為分析純。

RH-400KDE超聲波清洗器，LYNX4000高速離心機(jī)，GJ881-4電熱烘干箱，Sap分析天平，R-1001VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，Trace GC Ultra—DSQⅡ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 方法

1.2.1 大花黃牡丹籽含油量的測(cè)定

按GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測(cè)定》方法測(cè)定。黃牡丹籽粒在烘箱中55 ℃烘干48 h至水分為(8.60±0.51)%，以剝殼前后粉碎至20～40目的牡丹籽(仁)粉為原料，精確稱取10.000 g樣品，用經(jīng)脫脂處理過(guò)的濾紙包好，放入索氏抽提器中，分別以石油醚和正己烷為提取溶劑，在抽提時(shí)間為1、2、3、4、5 h測(cè)定含油量。

1.2.2 大花黃牡丹籽油的提取

稱取15.000 g 大花牡丹籽仁粉末于圓底燒瓶中，按一定比例加入正己烷，置于超聲波清洗器中提取一定時(shí)間。抽濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除濾液中的正己烷，55 ℃下減壓干燥剩余物至恒重，準(zhǔn)確稱重，按公式計(jì)算大花黃牡丹籽油的提取率。

式中：M1為接收瓶和大花黃牡丹籽毛油的總質(zhì)量/g;M2為接收瓶的質(zhì)量/g；M為大花黃牡丹籽仁粉末質(zhì)量/g。

1.2.3 提取工藝的優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)：設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲功率120 W、樣品粒度40目、液料比8 mL/g，考察超聲提取時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)出油率的影響；設(shè)定超聲提取時(shí)間40 min、超聲功率120 W、樣品粒度40目、 液料比8 mL/g，考察超聲溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)出油率的影響；設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲提取時(shí)間40 min，樣品粒度40目、液料比8 mL/g，考察超聲功率40、80、120、160、200 W對(duì)出油率的影響； 設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲提取時(shí)間40 min、超聲功率120 W、樣品粒度40目， 考察液料比4、8、12、16、20 mL/g對(duì)出油率的影響；設(shè)定超聲溫度50 ℃、超聲提取時(shí)間40 min、超聲功率120 W、液料比8 mL/g，考察粒度40、60、80、100、120目對(duì)出油率的影響。

正交設(shè)計(jì)：前期實(shí)驗(yàn)表明，超聲提取時(shí)間、提取溫度、超聲波功率、液料比、樣品粒度大小對(duì)出油率均有不同程度的影響。為了減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，并考察各因素之間交互作用對(duì)出油率的影響，擬采用L16(215)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。在前期實(shí)驗(yàn)中，觀察到超聲提取時(shí)間與液料比(AE)、超聲提取時(shí)間與樣品粒度(BD)、超聲波功率與液料比(CE)的相互作用很小，因此設(shè)置為空列。

表1 L16(215)正交設(shè)計(jì)

1.2.4 理化指標(biāo)測(cè)定

碘價(jià)：參照GB/T 5009.299—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中碘價(jià)的測(cè)定》；皂化值：參照GB/T 5534—2008《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中皂化值的測(cè)定》；過(guò)氧化值：參照GB/T 5009.227—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品過(guò)氧化值的測(cè)定》；參照GB/T 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》；折光指數(shù)：用阿貝折光儀測(cè)定。

1.2.5 大花黃牡丹籽油微量活性物質(zhì)分析

生育酚的測(cè)定參照GB 5009.82—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素 A、D、E 的測(cè)定》中維生素E測(cè)定方法進(jìn)行；甾醇測(cè)定參照 GB/T 25223—2010；角鯊烯測(cè)定參照SNT 4785—2017中的氣相色譜-質(zhì)譜法。

1.2.6 大花黃牡丹籽油脂肪酸分析

脂肪酸的甲酯化：稱取樣品0.5 g置于50 mL離心管，加入5 mL正己烷、15mL 10%乙酰氯-甲醇溶液，瓶口封死，在80 ℃水浴反應(yīng)2 h，每隔20 min振搖1次，取出冷卻室溫，加入6%碳酸鈉10 mL，再加入5 mL正己烷，振蕩30 min，取出上清液過(guò)0.22 μm濾膜，濃度過(guò)高時(shí)再稀釋100倍后待測(cè)。

氣相色譜條件：色譜柱：HP-wax，30 m×0.25 mm，0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持1 min，以7 ℃/min升溫至210 ℃，保持 5 min，再以1.5 ℃/min升溫至240 ℃；載氣：高純氦(純度>99.999%)，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊電離源(EI)；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲：5 min；掃描方式：離子掃描(SIM)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用正交設(shè)計(jì)助手II3.11作正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并進(jìn)行極差分析、方差分析和差異顯著性分析(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)；應(yīng)用SPSS18.0 軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤、單因素差異顯著性分析；應(yīng)用Origin8.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花黃牡丹籽含油量

由圖1可知，在1～3 h內(nèi)所有樣品的出油率明顯增加，石油醚的提油速度比正己烷快，3 h后2種溶劑的提油率無(wú)顯著差異(P>0.05)，5 h后2種溶劑的提油率基本一致。以5 h作為提取終點(diǎn)，以2種溶劑提油率作綜合計(jì)算，去殼樣品出油率為(39.51±1.04)%，帶殼樣品出油率為(28.26±1.22)%，此結(jié)果視為大花黃牡丹籽的含油量。去殼樣品與帶殼樣品之間出油率差異極顯著(P<0.01)，可能是果殼中部分脂溶性色素物質(zhì)溶出，使得帶殼樣品的油脂顏色明顯比去殼樣品的深。基于操作安全性考慮，后期實(shí)驗(yàn)選擇正己烷作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑和時(shí)間對(duì)大花黃牡丹籽出油率的影響

2.2 各因素對(duì)大花黃牡丹籽油提取率的影響

提高提取溫度可加劇溶劑和油脂的分子熱運(yùn)動(dòng)，提高擴(kuò)散速率，從而提高出油率。由圖2 可知，在50 ℃時(shí)出油率達(dá)到最大值。處理溫度過(guò)高，正己烷揮發(fā)加劇，反而減少了正己烷與樣品的接觸面積，降低了擴(kuò)散速率[23]，大花黃牡丹籽出油率反而下降。結(jié)果表明，50 ℃為適當(dāng)?shù)奶崛囟取?/p>

圖2 大花黃牡丹籽油單因素提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同超聲提取時(shí)間對(duì)大花黃牡丹籽提油率的影響如圖2，在10～50 min內(nèi)，提油率隨超聲提取時(shí)間的增加而增加。超聲處理40 min 時(shí)出油率為37.10%，50 min時(shí)出油率為37.71%，兩者差異不明顯，原因是油脂在提取液和物料中的濃度達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，其出油率基本穩(wěn)定[24]。因此，最適超聲提取時(shí)間為40 min。

超聲波功率越大，其產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化作用越劇烈，油脂滲透出來(lái)的速度就越快[25]。當(dāng)超聲功率過(guò)大，可能引起自由基降解脂肪酸組分，導(dǎo)致出油率增加緩慢甚至下降[26]。由圖2 可知，超聲波功率160 W時(shí)出油率最高。

減小原料的粒徑有利于提高植物油的提取率，油料破碎不完全時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)未被破壞，提取溶劑無(wú)法與完整細(xì)胞中的油接觸而不能充分地將細(xì)胞中的油提取出來(lái)[27]。粉碎粒度過(guò)小，原料的堆積密度增大，溶劑的擴(kuò)散阻力增大，提取率反而下降[28]，圖2表明，樣品粒度為100目時(shí)提油率最高。

有效濃度差是油脂提取的主要推動(dòng)力，因此大花黃牡丹籽出油率隨著液料比的增大而增加，液料比大于12 mL/g時(shí)，出油率的增加緩慢，再增大液料比對(duì)大花黃牡丹籽出油率的影響不明顯。可能是大花黃牡丹籽中油脂含量逐漸減少，有效濃度差小，再增加溶劑用量的作用甚微[25]。

2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定正交實(shí)驗(yàn)各因素的水平如表2所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 L16(215)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3可知，根據(jù)R值大小可判斷出各因素和交互項(xiàng)對(duì)出油率的影響主次順序?yàn)椋篍→ED→BE→B=D→AC→BC→A=AB→AD→CD→C。E2>E1，E因素應(yīng)選E2；BE、ED交互作R值大于B、D項(xiàng)，B、D水平的選擇由BE、ED交互項(xiàng)決定,AC交互項(xiàng)R值分別大于A、C，A、C水平的選擇由AC決定，由表4和表5可知，應(yīng)選D2、A2、C2；表4中，在選擇E2的條件下，B1E2水平雖比B2E2水平略大，但比表3中B項(xiàng)中B2水平小，因此B因素應(yīng)B2水平。各因素對(duì)提油率最優(yōu)組合為：A2B2C2D2E2,即處理溫度60 ℃、超聲提取時(shí)間50 min、超聲功率160 W、樣品粒度100目、液料比12 mL/g。

表4 AC、ED、EB二元表

2.3.3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

以2.3.2得到的優(yōu)化組合，即處理溫度60 ℃、超聲提取時(shí)間50 min、超聲功率160 W、樣品粒度100目、液料比12 mL/g，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，提油率為(38.24±0.63)%，優(yōu)于正交設(shè)計(jì)的結(jié)果。

2.4 大花黃牡丹籽的理化性質(zhì)

由表6可知，正已烷與石油醚提取的大花黃牡丹籽油的碘價(jià)、酸價(jià)、皂化價(jià)、過(guò)氧化值差異不顯著(P>0.05)，碘值的高低與油脂中不飽和雙鍵的多少有關(guān)，雙鍵的數(shù)目越多碘值就越高，說(shuō)明大花黃牡丹籽油不飽和程度大，對(duì)人體的健康較有利；酸價(jià)是一種脂肪中游離脂肪酸含量的指標(biāo)，酸價(jià)越小，說(shuō)明油脂質(zhì)量越好，這一特性將有利于大花黃牡丹籽油后期的精煉工藝；皂化值表示油脂中脂肪酸相對(duì)分子質(zhì)量的大小，皂化值越大，脂肪酸相對(duì)分子質(zhì)量越小，大花黃牡丹籽油皂化值在藥典規(guī)定的注射用油皂化值185～200 mgKOH/g 范圍內(nèi)；大花黃牡丹籽油過(guò)氧化值小于1.56 mmol/kg，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所提取的油中雙鍵被氧化程度低?？傮w上，大花黃牡丹籽油理化指標(biāo)均符合LS/T 3242—2014《牡丹籽油》。所用的 2 種溶劑中，正己烷提取出油率高，油脂色澤和透明度、碘價(jià)、酸價(jià)、皂化價(jià)等指標(biāo)與石油醚提取差異小，操作安全性優(yōu)于石油，為大花黃牡丹籽油的理想溶劑。

表5 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

表6 大花黃牡丹籽與其他牡丹籽油脂理化性質(zhì)比較

與相關(guān)文獻(xiàn)相比較，發(fā)現(xiàn)大花黃牡丹籽油的碘價(jià)略低于各地各類牡丹籽油，與湖南湘西的野生牡丹籽油基本一致；酸價(jià)、過(guò)氧化值與滇牡丹籽油接近，除高于湖南湘西的野生牡丹籽油外，明顯低于其他牡丹籽油；皂化價(jià)與各地各類牡丹籽油的差異??；折光指數(shù)略小于其他牡丹籽油[29-32]?？傮w上，西藏大花黃牡丹籽油的理化特性與滇牡丹籽油、湘西野生牡丹籽油較接近，均屬于優(yōu)質(zhì)油脂。

2.5 大花黃牡丹籽油的部分功能成分

分別檢測(cè)了大花黃牡丹籽油中角鯊烯和VE部分甾醇含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 大花黃牡丹籽油的部分微量活性物質(zhì)含量

從表7可知，大花黃牡丹籽油中VE總含量達(dá)550.27 mg/kg，以γ-生育酚為主。經(jīng)典理論認(rèn)為α-生育酚是活性最高，營(yíng)養(yǎng)效價(jià)最好的VE，而近年來(lái)一些研究表明,γ-生育酚可能是VE實(shí)際上的心血管保護(hù)成分,并有抗癌和防癌作用[33]，因此大花黃牡丹籽的保健作用值得深入研究；在大花黃牡丹籽油中檢測(cè)到β-谷甾醇4.94 μg/mL，巖藻甾醇4.33 μg/mL，角鯊烯153.67 μg/mL，與內(nèi)地牡丹籽油相比，甾醇含量偏低，而角鯊烯則高出2～4倍[34]。

2.6 大花黃牡丹籽油的脂肪酸分析

經(jīng)過(guò)GC-MS檢測(cè)分析得到脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖和大花黃牡丹籽油樣品離子流圖，見(jiàn)圖3。大花黃牡丹籽油樣品檢測(cè)出20種脂肪酸，見(jiàn)表8，其中飽和脂肪酸為14種，單不飽和脂肪酸3種，多不和脂肪酸為3種。依據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算，棕櫚酸(9.31%)、油酸(41.03%)、亞油酸(16.02%)、α-亞麻酸(29.90%)是大花黃牡丹籽油的主要脂肪酸成分。油脂以不飽和脂肪酸為主，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)87.44%，其中多不飽和脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.04%。α-亞麻酸具有降低血脂及膽固醇，促進(jìn)脂肪代謝及肝細(xì)胞再生等功效，被譽(yù)為“植物腦黃金”。普通的牡丹籽油中α-亞麻酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在32%以上[35]，西藏大花黃牡丹籽油α-亞麻酸含量比普通牡丹籽油低，而西藏大花黃牡丹籽含油量比普通牡丹籽高。

表8 大花黃牡丹籽油主要脂肪酸組成

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大花黃牡丹籽油脂肪酸的分析結(jié)果與曾秀麗等[22]的分析結(jié)果相近，證明了西藏大花黃牡丹籽油與普通牡丹籽油的脂肪酸在組成與含量上均有較大的差別。西藏大花黃牡丹籽油主要脂肪酸中，油酸>α-亞麻酸>亞油酸>棕櫚酸>硬脂酸，而多數(shù)普通牡丹籽油α-亞麻酸含量最高，通常是亞麻酸>亞油酸>油酸>棕櫚酸>硬脂酸。大花黃牡丹籽油是優(yōu)質(zhì)的 ω-3保健食用油，在醫(yī)藥工業(yè)、高級(jí)化妝品、高級(jí)潤(rùn)滑油等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

西藏大花黃牡丹籽去殼樣品含油量為(39.51±1.04)%，帶殼樣品含油量為(28.26±1.22)%；通過(guò)L16(215)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取工藝為處理溫度60 ℃、超聲提取時(shí)間50 min、超聲功率160 W、樣品粒度100目、液料比12 mL/g。在此工藝條件下大花黃牡丹籽的出油率為(38.24±0.63)%，占大花黃牡丹籽含油量的97%，說(shuō)明正交設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果適合于大花黃牡丹籽油提取工藝，為西藏大花黃牡丹籽油規(guī)模化提取工藝提供了參考。2種溶劑提取的大花黃黃牡丹籽油理化指標(biāo)均符合LS/T 3242—2014要求并處于優(yōu)質(zhì)水平。正己烷提取的大花黃牡丹籽油中檢測(cè)出以γ-生育酚為主的VE總含量550.27 mg/kg，β-谷甾醇4.94 μg/mL，巖藻甾醇4.33 μg/mL，角鯊烯153.67 μg/mL。牡丹籽油中含20種脂肪酸組分，主要由亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸組成，其中亞麻酸占總脂肪酸含量的29.90%。大花黃牡丹籽油中含不飽和脂肪酸6種，占其脂肪酸總量的87.44%，其中單不飽和脂肪酸3種，占41.40%，多不和脂肪酸為3 種，占46.04%，飽和脂肪酸占其總量的12.56%。