于園超 洪明陽 周 丹 朱曉彤

(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110122)

瘧疾是由瘧原蟲引起的寄生原蟲感染性疾病。近年來，全球瘧疾防控使瘧疾流行范圍逐漸縮小，但死亡率仍居高不下且發(fā)病人數(shù)有所回升，瘧疾消除工作停滯不前(閆妍等，2018)。實(shí)現(xiàn)消滅瘧疾的一種潛在方法是使用傳播阻斷疫苗(Transmission Blocking Vaccines, TBVs)(Nunesetal.，2014)。TBVs可誘導(dǎo)宿主體內(nèi)產(chǎn)生有性發(fā)育階段特異性抗體，抗體隨瘧原蟲感染血液被按蚊吸食入體內(nèi)以阻止瘧原蟲在蚊胃內(nèi)的進(jìn)一步發(fā)育(Leetal.，2019)。傳播阻斷疫苗的靶位是有性發(fā)育階段的瘧原蟲，其功能作用不受人體免疫系統(tǒng)的干擾(Schwartzetal.，2012)。目前研究發(fā)現(xiàn)的多個(gè)瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原，如P25、P28、P48/45、P230和HAP2/GCS1雖具有顯著的傳播阻斷效果，但均不能徹底阻斷瘧疾傳播(Lennartzetal.，2018)。因此，開發(fā)新型瘧疾傳播阻斷疫苗仍迫在眉睫。

瘧原蟲體內(nèi)的可逆性磷酸化修飾在原蟲生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用(Govindasamyetal.，2019)。因此，參與此修飾過程的蛋白激酶和磷酸酶是潛在的抗瘧藥物和疫苗研發(fā)靶點(diǎn)(Strickeretal.，2006)。研究發(fā)現(xiàn)，瘧原蟲編碼大約85個(gè)蛋白激酶和30個(gè)蛋白磷酸酶(Wardetal.，2004)，且具有人類所有主要磷蛋白磷酸酶(PPP)亞科PP1-PP7的所有同源基因(Kutuzovetal.，2008)。PP6屬于 PP2A家族，參與細(xì)胞周期的調(diào)控，如Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，Plk1)和 PP6相互作用產(chǎn)生一個(gè)反饋回路，其可加強(qiáng)有絲分裂時(shí)Plk1和Aurora a的活動(dòng)，并通過降解Plk1終止有絲分裂過程(Kettenbachetal.，2018)。在酵母中，PP6在染色體分離和紡錘體組裝過程中發(fā)揮重要作用(Rusinetal.，2015)。氨基酸序列預(yù)測分析顯示，惡性瘧原蟲PP6的催化結(jié)構(gòu)域與 PPP 其他成員高度同源且保守(Dobsonetal.，2003)，但PP6在瘧原蟲中的作用尚不明確。

本文采用生物信息學(xué)分析選取約氏瘧原蟲PP6(PlasmoDB ID: Py02284，PyPP6)優(yōu)勢抗原表位區(qū)域制備鼠源性多克隆抗體，并通過ELISA和Western blot檢測抗-PyPP6抗體的效價(jià)及其特異性。間接免疫熒光檢測PyPP6蛋白在約氏瘧原蟲各發(fā)育階段的定位情況。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評估抗-PyPP6抗體的傳播阻斷效果。本研究旨在為探索瘧原蟲新型傳播阻斷疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性6～8周齡BALB/c小鼠(北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，Py17XL約氏瘧原蟲株(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室)。限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI(ThermoFisher)、In-Fusion HD(Clontech)、快速質(zhì)粒小提試劑盒(天根)、TaKaRa Agarose Gel DNA Extraction Kit v4.0(TaKaRa)、HisPurTMNi-NTA Magnetic Beads(ThermoFisher)、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(ThermoFisher)、6×His Tag monoclonal antibody(ThermoFisher)、RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、Tween-20(北京鼎國)、Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)、Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody, HRP(Thermo Fisher)、Kod-Plus-Neo(TOYOBO)、LB(Solarbio)、DAPI(Invitrogen)、IPTG(Genview)、PVDF膜(Millipore)、4×LDS Sample Buffer(Invitrogen)。

1.2 目的基因合成及原核表達(dá)載體構(gòu)建

以Py17XL原蟲gDNA為模板，采用特異性引物通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增PyPP6目的片段。將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化后連接到pET32a(+)原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。挑取陽性菌落進(jìn)行質(zhì)粒小提酶切鑒定及測序比對，篩選正確的pET32a(+)-PyPP6質(zhì)粒。

1.3 重組蛋白的表達(dá)、純化

選取pET32a(+)-PyPP6鑒定正確菌種，采用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后20 ℃搖菌過夜。次日，收菌后超聲裂解，采用HisPurTMNi-NTA Magnetic磁珠純化PyPP6-his重組蛋白后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色30 min后，甲醇—乙酸脫色檢測重組蛋白提純效果。采用重組蛋白與4×LDS Sample Buffer預(yù)混后，100 ℃水浴鍋煮沸3 min，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。25 V半干法轉(zhuǎn)膜30 min后，采用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1.5 h后，TBS-T漂洗3次，每次10 min。采用6×His Tag Monoclonal Antibody(1∶2 000)孵育，4 ℃過夜。TBS-T洗滌后，采用HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(1∶20 000)室溫孵育1 h，TBS-T漂洗3次，每次10 min后，采用ECL發(fā)光方法檢測結(jié)果。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫

將20只雌性6～8周齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組。組1小鼠免疫PBS(PBS)；組2為PyPP6重組蛋白免疫組(PyPP6)。初次免疫重組蛋白(50 μg/只)與完全弗氏佐劑1∶1充分混合皮下注射，二免和三免采用重組蛋白和不完全弗氏佐劑1∶1充分混合，每間隔14 d免疫1次，共免疫3次。3免后第10 d收集各免疫組小鼠血清，-80 ℃保存。

1.5 ELISA法檢測免疫血清效價(jià)

采用10 μg PyPP6重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，室溫過夜。采用含1% BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)封閉96孔板，37 ℃孵育l h。每孔加入100 μL倍比稀釋后的待檢測免疫血清，37 ℃孵育 2 h。PBS-T洗板5次后，每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1∶5 000)，37 ℃孵育l h。PBS-T洗板5次后，加入底物鄰苯二胺和過氧化氫顯色5 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。采用Bio-Rad酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。

1.6 Western blot檢測抗-PyPP6免疫血清特異性

純化并收集環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體和動(dòng)合子期Py17XL原蟲蛋白進(jìn)行Western blot檢測。采用抗-PyPP6免疫血清(1∶200)檢測PyPP6蛋白在Py17XL原蟲各發(fā)育階段的表達(dá)情況。

1.7 IFA 進(jìn)行PyPP6蛋白的亞細(xì)胞定位

分別收集Py17XL的環(huán)狀體、裂殖體、雌/雄配子體、出絲、動(dòng)合子期原蟲于1.5 mL EP管中，采用4%多聚甲醛/0.0075%的戊二醛室溫固定3 h后，0.1 mg/mL硼氫化鈉室溫中和10 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS洗滌3次后，采用anti-PyPP6血清(1∶200)室溫孵育2 h。PBS洗滌5次后，采用Alexa FluorTM488 goat anti-mouse IgG(H+L)(1∶500)避光室溫孵育1 h。1 μg/mL DAPI染核后封片，Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡檢測PyPP6在原蟲各發(fā)育階段的定位情況。

1.8 抗-PyPP6免疫血清對瘧原蟲有性發(fā)育階段抑制效果的觀察

雌性6～8周齡BALB/c小鼠感染前2 d注射苯肼(200 μL/只；濃度：6 mg/mL)，采用1×107個(gè)Py17XL腹腔注射感染BALB/c小鼠，待感染后第2 d喂磺胺，感染第3 d取10 μL小鼠尾血與40 μL動(dòng)合子培養(yǎng)基(RPMI1640培養(yǎng)基+25%胎牛血清+青霉素+鏈霉素)并加入1∶5稀釋的抗-PyPP6免疫血清混合，24 ℃，15 min孵育后取1 μL涂片，30 min內(nèi)計(jì)數(shù)40倍視野下的雌/雄配子體數(shù)目、雌/雄配子數(shù)和雄配子出絲數(shù)目。動(dòng)合子培養(yǎng)采取小鼠尾血與動(dòng)合子培養(yǎng)基1∶9比例，19 ℃培養(yǎng)24 h后，取1 μL培養(yǎng)體系/孔制備熒光片，采用抗-Pys25抗體(1∶200)染色，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)動(dòng)合子數(shù)目并計(jì)算動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率。

1.9 按蚊飼養(yǎng)和蚊飼實(shí)驗(yàn)

雌性按蚊采用常規(guī)方法在溫度為25°C，濕度為50%～80%，晝夜節(jié)律12 h的條件下每天采用10 %(w/v)葡萄糖水喂養(yǎng)(Wangetal.，2013)。采用1×107個(gè)Py17XL腹腔感染BALB/c小鼠，感染后第3 d，隨機(jī)分為PyPP6組和PBS組，每組2只小鼠。直接蚊飼實(shí)驗(yàn)前1 h，PyPP6組和PBS組小鼠分別尾靜脈注射100 μL抗-PyPP6免疫血清和抗-PBS免疫血清，蚊飼2 h，7 d后解剖按蚊取胃并計(jì)數(shù)每只按蚊胃中卵囊數(shù)目。

2.0 數(shù)據(jù)處理

本研究中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行分析繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。血清抗體滴度、配子體率、雌/雄配子體激活率、雄配子出絲、雄配子結(jié)合雌配子的能力、動(dòng)合子數(shù)目和動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率采用Student′sttest檢驗(yàn)進(jìn)行比較；卵囊數(shù)目采用 Mann-WhitneyUtest。P<0.05提示組間顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 PyPP6重組蛋白的表達(dá)及抗-PyPP6免疫血清抗體滴度檢測

本研究中成功誘導(dǎo)PyPP6重組蛋白的表達(dá)，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果圖顯示，PyPP6重組蛋白純度>90%，蛋白大小約49.9 kDa(圖1-A)。ELISA結(jié)果顯示，抗-PyPP6免疫血清的抗體滴度為1∶128 000(圖1-B)。

圖1 PyPP6重組蛋白表達(dá)檢測

2.2 Western blot檢測PyPP6蛋白在約氏瘧原蟲各發(fā)育階段的表達(dá)情況

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗-PyPP6免疫血清具有良好的免疫反應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)PyPP6蛋白在約氏瘧原蟲的環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體及動(dòng)合子期均有表達(dá)，且蛋白大小符合預(yù)期大小，約為36 kDa。本實(shí)驗(yàn)采用Hsp70作為內(nèi)參蛋白(圖2)。

圖2 PyPP6蛋白在原蟲各發(fā)育階段表達(dá)水平檢測

2.3 IFA 檢測PyPP6蛋白在瘧原蟲各發(fā)育階段的亞細(xì)胞定位

本研究通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PP6蛋白在約氏瘧原蟲的環(huán)狀體，裂殖體，雌/雄配子體和動(dòng)合子階段均有表達(dá)。其中，動(dòng)合子期PyPP6熒光信號定位在原蟲質(zhì)膜，且0.1%Triton X-100未處理組(Ook Triton X-100(-))仍可檢測到PyPP6熒光信號，并與約氏瘧原蟲表面抗原Pys25蛋白定位模式相似，提示PyPP6為動(dòng)合子期原蟲表面蛋白(圖3)。

2.4 抗-PyPP6免疫血清對配子體率、配子活化和受精能力的影響

與PBS組相比，抗-PyPP6免疫血清(1∶5)對配子體率及雌/雄配子體活化能力均無明顯影響(圖4-A和4-B)。但與對照組相比，抗-PyPP6血清處理組，雄配子出絲減少了61.5%(P< 0.05，圖4-C)，雄配子粘附雌配子能力下降44.6%(P<0.0001，圖4-D)，提示抗-PyPP6免疫血清可影響雄配子受精功能。

圖4 抗-PyPP6免疫血清對配子體期原蟲發(fā)育的影響

2.5 抗-PyPP6免疫血清對體外動(dòng)合子期原蟲發(fā)育的影響

從圖5-A可以看出，1∶5稀釋的抗-PyPP6免疫血清處理組(PyPP6)動(dòng)合子的形成數(shù)量明顯減少了75%(P< 0.01)，且動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率下降了19.7%(P< 0.01，圖5-B)。上述結(jié)果提示：抗-PyPP6免疫血清對體外動(dòng)合子的形成及發(fā)育具有顯著的抑制作用。

圖5 抗-PyPP6免疫血清對動(dòng)合子發(fā)育的影響

2.6 抗-PyPP6免疫血清對卵囊形成數(shù)量的影響

蚊飼實(shí)驗(yàn)觀察顯示，與對照組相比，吸食抗-PyPP6免疫血清被動(dòng)轉(zhuǎn)移組小鼠血液的按蚊胃內(nèi)卵囊形成數(shù)目明顯減少(P< 0.0001，圖6)。與對照組相比，按蚊感染率下降1.5%，而蚊胃內(nèi)卵囊密度減少35%(表1)。上述結(jié)果提示抗-PyPP6免疫血清可顯著抑制蚊體內(nèi)卵囊形成。

圖6 抗-PyPP6免疫血清對卵囊形成的影響

表1 抗-PyPP6免疫血清對約氏瘧原蟲有性階段的影響

3 討論

蛋白質(zhì)的可逆性磷酸化修飾在瘧原蟲的生長、發(fā)育和致病等多個(gè)過程中發(fā)揮重要作用(Miliuetal.，2017)。蛋白激酶和磷酸酶參與蛋白磷酸化修飾的調(diào)控過程，蛋白激酶作為傳統(tǒng)的抗瘧治療藥物靶標(biāo)已獲得廣泛關(guān)注和研究，而關(guān)于蛋白磷酸酶的研究尚處于起步階段。有研究表明，30種磷酸酶中有16種是瘧原蟲有性階段生長發(fā)育所必須，如PPM1及PPM2分別參與活化雄配子和雌配子分化及動(dòng)合子轉(zhuǎn)化，PPK1參與合子和動(dòng)合子的發(fā)育，SHLP1可介導(dǎo)動(dòng)合子滑動(dòng)，PPM5和PP1參與卵囊形成(Gutteryetal.，2014; Hollinetal.，2019)；而PP5蛋白參與雄配子形成和發(fā)育影響瘧原蟲有性階段的生長(Zhuetal.，2019)。同時(shí)，前期研究中發(fā)現(xiàn)，伯氏瘧原蟲PP6蛋白(PbPP6)在動(dòng)合子階段定位于原蟲質(zhì)膜，其特異性免疫血清可顯著抑制雄配子出絲、動(dòng)合子形成、動(dòng)合子轉(zhuǎn)化和蚊胃內(nèi)卵囊發(fā)育。上述結(jié)果提示PbPP6蛋白參與瘧原蟲有性發(fā)育階段(孫林等，2019)，可作為潛在的傳播阻斷疫苗靶位。本研究旨在通過探討PbPP6在約氏瘧原蟲中同源蛋白PyPP6的定位和表達(dá)情況，同時(shí)分析其免疫血清的傳播阻斷效果，從而全面檢測不同種屬瘧原蟲中PP6蛋白作為傳播阻斷疫苗靶位的可行性。

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組PBS相比，PyPP6蛋白具有良好的免疫原性。候選TBVs通常定位于有性發(fā)育階段(配子、合子和動(dòng)合子)原蟲質(zhì)膜表面(Sauerweinetal.，2015)。本研究中，通過IFA 檢測，發(fā)現(xiàn)PyPP6定位于雄配子和雌配子原蟲質(zhì)膜表面，提示其可能參與雌/雄配子受精過程。同時(shí)，PyPP6蛋白表達(dá)在合子/動(dòng)合子期原蟲質(zhì)膜表面，且抗-PyPP6免疫血清可顯著抑制動(dòng)合子形成和轉(zhuǎn)化，提示PyPP6蛋白同時(shí)參與動(dòng)合子的發(fā)育過程。綜上，PyPP6蛋白可作為傳播阻斷疫苗候選抗原。

目前發(fā)現(xiàn)的TBVs包含表達(dá)于配子體和配子表面受精前疫苗候選抗原：P230、P48/45和HAP2等；表達(dá)于蚊體內(nèi)的受精后疫苗候選抗原：P25和P28等(Zhengetal.，2019)。由于瘧疾感染患者存在針對上述抗原的天然抗體，故受精前疫苗具有增強(qiáng)免疫的作用，而受精后疫苗可延長或者阻斷瘧原蟲發(fā)育過程，所以兩者均具有較好的傳播阻斷活性(Leeetal.，2020)。前期研究發(fā)現(xiàn)，Pfs230其傳播阻斷效果可達(dá)80%；HAP2免疫血清可使卵囊發(fā)育降低97%(Acquahetal.，2019)。雖然均有顯著的傳播阻斷效果，但仍不能完全阻斷瘧疾傳播。而本研究中的PyPP6蛋白在瘧原蟲受精前和受精后均有表達(dá)。受精前顯示，抗-PyPP6免疫血清(1∶5)對配子體率和配子體激活無影響，但可顯著抑制雄配子出絲和受精功能，提示PyPP6蛋白可能參與受精前的配子體出絲過程，因此可作為受精前疫苗的靶位。受精后，雖然抗-PyPP6免疫血清對蚊階段發(fā)育的阻斷效果不如抗-Pfs25(>90%)(Kapuluetal.，2015)，但仍可顯著抑制動(dòng)合子形成及動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率，提示PyPP6蛋白可能參與受精后的動(dòng)合子發(fā)育過程，因此可作為受精后疫苗的靶位。體內(nèi)蚊飼實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明PyPP6在受精后具有顯著的傳播阻斷效果。本研究中獲得的抗-PyPP6免疫血清的傳播阻斷效果與前期研究中獲得的抗-PbPP6免疫血清的傳播阻斷效果相近(1∶5倍稀釋的抗-PbPP6免疫血清可使配子體出絲數(shù)目減少62.5%；動(dòng)合子數(shù)目顯著下降65.3%；動(dòng)合子轉(zhuǎn)化率下降42.07%)。蛋白序列比對分析顯示，PyPP6與PbPP6蛋白同源性為99.7%。高度相近的蛋白同源性，可能是兩種免疫血清具有相近傳播阻斷效果的生物學(xué)基礎(chǔ)，提示抗-PP6的免疫血清可能對不同種屬的瘧原蟲感染具有交叉保護(hù)效果。

本實(shí)驗(yàn)對PyPP6在瘧原蟲各發(fā)育階段的表達(dá)和定位以及抗-PyPP6免疫血清的傳播阻斷效應(yīng)進(jìn)行了綜合評估。研究表明：PyPP6重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。約氏瘧原蟲抗-PyPP6免疫血清具有一定的傳播阻斷效果。本研究為瘧原蟲傳播阻斷疫苗的研發(fā)提供了必要的前期基礎(chǔ)。