余蓉培，汪國鮮，阮繼偉，吳麗芳，單芹麗，楊春梅*

(1 云南農業(yè)科學院花卉研究所, 國家觀賞園藝工程技術研究中心，昆明650205；2 玉溪云星生物科技有限公司，云南玉溪653100；3 云南大學 生命科學學院，昆明 650091)

蕨類植物(ferns)又稱羊齒植物，是位于苔蘚植物和種子植物之間的過渡類群。蕨類植物具有明顯的世代交替，即：小而簡單的單倍體配子體世代和大而復雜的二倍體孢子體世代，是維管束植物中配子體和孢子體都能夠獨立生存的唯一類群[1]。同型孢子蕨類的孢子萌發(fā)后，會形成雄配子體、雌配子體、兩性配子體等不同性別配子體[2]，同時，也可能有無性配子體形成[3]。同型孢子蕨類植物中，除了極少數(shù)種類的配子體性別分化受遺傳因素影響[4]，大部分種類的配子體性別分化受環(huán)境因子調控[5]。蕨類植物配子體性別分化研究對于揭示植物性別決定機制和植物不同進化類群有性生殖的特異性具有重要意義[5]，同時，還對觀賞蕨類人工繁育技術及雜交育種研究具有重要參考價值。

現(xiàn)有研究表明，配子體性別分化受激素[6-8]、培養(yǎng)密度[3, 9-10]、光照[11-12]、營養(yǎng)物質[2,13]等環(huán)境因子影響。目前，蕨類植物配子體性別決定機制研究主要集中于水蕨(Ceratopterisrichardii)[2,14-15]、海金沙(Lygodiumjaponicum)[16]，已有研究顯示，成精子囊素(antheridiogens)由先成熟的兩性配子體產生并分泌到環(huán)境中，是一類與赤霉素結構類似的激素，能夠促進雄配子體形成而抑制雌配子體形成，在配子體性別分化中起關鍵作用。Tanaka等[16]提出并證實了成精子囊素介導的赤霉素信號通路在海金沙配子體性別分化中的調控模式。

金毛狗 [Cibotiumbarometz(L.) J. Sm.]，隸屬于金毛狗科(Cibotiaceae)金毛狗屬[17]，為多年生大型樹狀蕨類，在歐美地區(qū)，廣泛應用于庭院造景中[18]。金毛狗為國家二級重點保護野生植物[19]，同時也被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約(附錄II)》[20]。目前，尚未見金毛狗配子體性別分化研究的相關報道。本研究以金毛狗孢子為培養(yǎng)材料，探究培養(yǎng)密度、外源赤霉素、光質等環(huán)境因子對金毛狗配子體性別分化的影響，研究結果將為珍稀觀賞蕨類金毛狗人工繁育以及蕨類植物配子體性別決定機制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

金毛狗孢子采集于云南屏邊地區(qū)，孢子收集和保存參照余蓉培等[21]所述方法。

1.2 試驗方法

1.2.1孢子無菌培養(yǎng)參照余蓉培等[21]所述方法進行金毛狗孢子無菌培養(yǎng)。孢子無菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為：1/2MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂(pH 5.8)，暗培養(yǎng)24 h后，放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強度30～40 μmol·m-2·s-1，光照時間12 h·d-1，溫度25±2 ℃。

1.2.2配子體培養(yǎng)密度處理采用王曉倩等[22]所述方法對金毛狗孢子播種密度進行調控，形成不同的孢子培養(yǎng)密度，孢子萌發(fā)后將形成不同的配子體培養(yǎng)密度。培養(yǎng)80 d和100 d時，分別選取配子體培養(yǎng)密度為：1個/cm2、5個/cm2、(40±5)個/cm2、(80±5)個/cm2進行觀察，每個培養(yǎng)密度下隨機選取5組配子體(20個/組)，對不同性別配子體比率、單個配子體上精子器(頸卵器)平均數(shù)進行統(tǒng)計。試驗進行3次重復。

1.2.3配子體外源赤霉素處理對金毛狗孢子進行無菌培養(yǎng)，孢子萌發(fā)后1周左右，調整培養(yǎng)密度至1個/cm2，分別滴加不同濃度的GA4和GA3，濃度梯度為：0、0.01、0.1和1 μmol/L，每2周滴加一次。GA4和GA3處理后60 d進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，統(tǒng)計方式同上。試驗進行3次重復。

1.2.4配子體不同光質處理對金毛狗孢子進行無菌培養(yǎng)，孢子萌發(fā)后1周左右，調整培養(yǎng)密度至1個/cm2，分別放置于白、紅、藍的飛利浦LED燈下進行培養(yǎng)，光照強度均為40 μmol·m-2·s-1。光照處理后60 d進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，統(tǒng)計方式同上。試驗進行3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，所用方法為最小顯著差數(shù)法(LSD)，并使用Excel 2007繪圖。相關計算公式如下：

雌配子體比率 = (雌配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

雄配子體比率 = (雄配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

兩性配子體比率 = (兩性配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

無性配子體比率 = (無性配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

單個配子體上精子器平均數(shù) = 各性別配子體的精子器總數(shù)/配子體總數(shù)

單個配子體上頸卵器平均數(shù) = 各性別配子體的頸卵器總數(shù)/配子體總數(shù)

2 結果與分析

2.1 金毛狗配子體性別分化對培養(yǎng)密度的響應

2.1.1培養(yǎng)密度對金毛狗配子體性別比率的影響如圖1所示，低培養(yǎng)密度下(1個/cm2和5個/cm2)，配子體多為雌配子體；隨著培養(yǎng)密度的增加，雌配子比例下降，雄配子體和兩性配子體比率上升；配子體培養(yǎng)密度為40個/cm2時，雄配子體和兩性配子體比率達到最高，雄配子體多簇生于發(fā)育較早的兩性或雌配子體周圍。但在80個/cm2高培養(yǎng)密度下，雄配子體和兩性配子體比率均發(fā)生下降。隨著培養(yǎng)密度的增大，無性配子體比率相應增加，在80個/cm2的高培養(yǎng)密度下，無性配子體比率達40%以上。

與80 d相比，100 d時，低培養(yǎng)密度下(1個/cm2和5個/cm2)，雌配子體比率下降，兩性配子體比率上升，說明隨著培養(yǎng)時間延長，部分雌配子逐漸發(fā)育成為兩性配子體；40個/cm2時，隨著培養(yǎng)時間的延長，雄配子體比例下降，兩性配子體比例增加，說明部分雄配子體逐漸向兩性配子體發(fā)育。

2.1.2培養(yǎng)密度對金毛狗配子體性器官數(shù)量的影響如圖2所示，1個/cm2和5個/cm2時，金毛狗配子體上的頸卵器平均數(shù)量最多，隨著培養(yǎng)密度的增加，單個配子體上的頸卵器平均數(shù)量減少。40個/cm2時，配子體精子器平均數(shù)量最多，較低或較高培養(yǎng)密度下，精子器數(shù)量均較少。與80 d相比，100 d時，除80個/cm2下的精子器平均數(shù)量無顯著變化，其他處理下的頸卵器和精子器數(shù)量均有所增加。

2.2 金毛狗配子體性別分化對外源赤霉素的響應

2.2.1外源GA3和GA4對金毛狗配子體性別比率的影響如圖3所示，對照(無外源激素)除極少數(shù)有兩性配子體形成，其他均為雌配子體。不同濃度的GA4處理后，雌配子體比率顯著下降，雄配子體比率顯著增加，兩性配子體比例略微上升；0.1和1μmol/L處理后，可實現(xiàn)較高的雄配子形成率，未見無性配子體形成。但與GA4相比，GA3對金毛狗配子體性別分化的影響較為微弱，說明金毛狗配子體對GA4的敏感性更高。

圖1 培養(yǎng)密度對金毛狗配子體性別分化的影響Fig.1 Effect of cultivation density on the sex differentiation of Cibotium barometz gametophytes

GA4和GA3對金毛狗配子體性別分化影響的差異可能源于兩者分子結構上的差異，導致配子體對兩者的敏感性存在差異。

2.2.2外源GA3和GA4對金毛狗配子體性器官數(shù)量的影響如圖4所示，GA4處理后，金毛狗單個配子體上頸卵器平均數(shù)量減少，精子器平均數(shù)量增加，0.1和1 μmol/L GA4處理對頸卵器形成的抑制作用和精子器形成的促進作用較為顯著。相反，GA3處理對單個配子體上頸卵器和精子器的形成沒有產生顯著影響。

不同小寫字母表示同一時間不同培養(yǎng)濃度間差異顯著(P<0.05)圖2 培養(yǎng)密度對金毛狗配子體性器官形成的影響Different lowercase letters indicate that results of different cultivation density are significant each other (P<0.05) at the same timeFig.2 Effect of cultivation density on the sexual organ formation of C. barometz gametophytes

圖3 外源赤霉素GA3和GA4對金毛狗配子體性別分化的影響Fig.3 Effect of exogenous GA3 and GA4 on the sex differentiation of C. barometz gametophytes

不同小寫字母表示同一處理下不同培養(yǎng)濃度間差異顯著(P<0.05)圖4 外源赤霉素GA3和GA4對金毛狗配子體性器官形成的影響Different lowercase letters indicate that results of different cultivation density are significant each other (P<0.05) at the same treatmentFig.4 Effect of exogenous GA3 and GA4 on the sexual organ formation of C. barometz gametophyte

GA4處理后，部分配子體發(fā)育成為雄配子體(圖5，B～D)，0.1和1 μmol/L處理下，部分雄配子體上產生大量的精子器。但與典型的雄配子體形態(tài)(圖5，A)相比，GA4處理后形成的雄配子體可見較淺的“U” 形生長點，后期如果培養(yǎng)環(huán)境中缺乏GA4，存在向兩性配子體發(fā)育的可能性。

2.3 金毛狗配子體性別分化對光質的響應

2.3.1光質對金毛狗配子體性別分化的影響分別采用白光、紅光、藍光等不同光照處理后，均只有雌配子體和兩性配子體的形成，未見雄配子體和無性配子體形成(圖6)；且僅紅光處理下，兩性配子體比率略有上升，但未見雄配子體形成。說明光質在金毛狗的配子體性別分化中未起到關鍵作用。但不同光照對于金毛狗配子體發(fā)育及形態(tài)建成會產生一定影響。紅光和藍光處理下，部分配子體會形成新的增殖位點，并逐步發(fā)育形成新的配子體(圖7，A～C)。

2.3.2光質對金毛狗配子體性器官數(shù)量的影響分別采用白光、紅光、藍光等不同光照處理后，配子體的頸卵器和精子器平均數(shù)未產生顯著變化，紅光處理下，精子器數(shù)量雖略有增加，但差異不顯著。說明光照對金毛狗配子體性器官的形成沒有顯著影響。

A．正常的雄配子體；B. 0.01 μmol/L GA4處理后45 d；C. 0.1 μmol/L GA4處理后60 d；D. 1 μmol/L 處理后60 d。箭頭所示為精子器圖5 正常雄配子體和外源赤霉素GA4處理后形成的雄配子體A. Normal male gametophyte; B. 45 days after using 0.01 μmol/L GA4; C. 60 days after using 0.1 μmol/L GA4;D. 60 days after using 1 μmol/L GA4. Arrows indicate antheridiaFig.5 Normal male gametophytes and male gametophytes obtained after using exogenous GA4

不同小寫字母表示同一指標在不同光質間差異顯著(P<0.05)圖6 光照對金毛狗配子體性別分化和性器官形成的影響Different lowercase letters indicate that results of different light quality are significant each other (P<0.05) at the same indexFig.6 Effect of light on the sex differentiation and sexual organ formation of C. barometz gametophytes

A. 紅光處理，箭頭所示為新的增殖位點正在形成新的配子體；B～C. 藍光處理，箭頭所示為新的增殖位點正在形成新的配子體。圖7 光照對金毛狗配子體發(fā)育的影響A. Red light, arrows indicate the new multiplication points forming the new gametophytes; B-C. Blue light, arrows indicate the new multiplication points forming the new gametophytesFig.7 Effect of light on the gametophyte development of C. barometz

3 討 論

現(xiàn)有研究表明，培養(yǎng)密度會影響配子體的性別分化，培養(yǎng)密度較低時，配子體通常發(fā)育為雌性或兩性配子體，培養(yǎng)密度較高時，配子體則多發(fā)育為雄性或無性配子體[3]。在分株紫萁(Osmundacinnamomea)中，當培養(yǎng)密度為1～3個/cm2時，配子體體為雌配子體，培養(yǎng)密度大于60個/cm2時，配子體則多為無性配子體，培養(yǎng)密度在3～41個/cm2時，配子體以兩性配子體和雄性配子體居多[3]。在狗脊蕨(Woodwardiaradicans)中，隨培養(yǎng)密度增加，雄配子體比率增加，隨培養(yǎng)時間增長，兩性配子體比例增加[9]。水蕨(Ceratopteristhalictroides)配子體性別也會隨培養(yǎng)密度發(fā)生變化，低密度培養(yǎng)下發(fā)育為兩性配子體，高密度培養(yǎng)下發(fā)育為雄配子體[10]。本研究中，低培養(yǎng)密度下(1個/cm2和5個/cm2)，金毛狗配子體多為雌配子體；隨著培養(yǎng)密度的增加，雄配子體和兩性配子體比例上升；配子體培養(yǎng)密度為40個/cm2時，雄配子體和兩性配子體比例達到最高；培養(yǎng)密度增高至80個/cm2時，無性配子體比例顯著上升。金毛狗配子體性別隨培養(yǎng)密度的變化趨勢與分株紫萁相似[3]。隨著培養(yǎng)時間的延長，不同培養(yǎng)密度下兩性配子體比率都有所增加，與狗脊蕨的情況相似[9]。

成精子囊素能夠促進雄配子體形成而抑制雌配子體形成，其結構和化學性質與赤霉素類似[23]。已有研究顯示，外源GA3能夠誘導密穗蕨(Anemiaphyllitidis)精子器形成[8]。海金沙成精子囊素的主要成分為GA9甲酯[24]和GA73甲酯[25]，Tanaka 等[16]研究發(fā)現(xiàn)外源GA9甲酯和GA4能促進海金沙精子器形成，抑制頸卵器形成，并證實了成精子囊素對海金沙配子體的性別調控是通過赤霉素信號通路實現(xiàn)。Menendez等[26]采用外源GA4+7和GA3對烏毛蕨(Blechnumspicant)配子體進行處理，僅GA4+7對精子器和頸卵器的形成起輕微的促進作用，GA3未產生作用。本研究中，外源GA4能促進金毛狗精子器形成而抑制頸卵器形成，與GA4在海金沙配子體性別分化中的作用相同[16]，但外源GA3在金毛狗配子體性別分化中不產生顯著作用，這與密穗蕨存在差異，但與烏毛蕨中的情況相似[26]。在金毛狗配子體性別分化中，外源GA4和GA3的作用存在顯著差異，可能源于兩者分子結構上的差異，導致配子體對兩者的敏感性存在差異。

光質在不同蕨類植物的配子體性別分化中存在差異，紅光、遠紅光以及藍光對水龍骨屬(Polypodium)、鹿角蕨屬(Platycerium)、鐵角蕨屬(Asplenium)以及烏毛蕨屬的精子器形成產生抑制作用[12]。在密穗蕨精子器形成過程中，藍光起促進作用，紅光起抑制作用，但都依賴于Ca2+的存在[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，光質在金毛狗配子體性別分化中未產生顯著作用，但對金毛狗配子體發(fā)育和形態(tài)建成會產生一定影響。

綜上所述，培養(yǎng)密度和外源GA4等環(huán)境因子對金毛狗配子體性別分化和性器官形成產生影響，但由此產生的配子體性別分化對后期孢子體形成以及有性繁殖效率的影響還有待進一步深入研究。