劉 艷 李 梅 邱星輝**

(1.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所農(nóng)業(yè)蟲(chóng)害鼠害綜合治理研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

家蠅是一種重要的病媒生物，可以傳播上百種人畜疾病，如霍亂、痢疾、腸出血性大腸桿菌、禽流感病毒以及導(dǎo)致死亡的抗生素抗性細(xì)菌等(Scottetal., 2014)。家蠅繁殖能力非常強(qiáng)，單雌產(chǎn)卵量可達(dá)千粒，在適宜的溫濕度條件下每10～14 d就可以完成一個(gè)世代，如不加控制，將帶來(lái)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生災(zāi)害。家蠅的控制長(zhǎng)期以來(lái)主要依靠化學(xué)殺蟲(chóng)劑，其中擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑由于高效、對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低以及在環(huán)境中易分解等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。由于擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的大量使用，家蠅種群普遍對(duì)這類(lèi)藥劑產(chǎn)生了抗藥性(Gaoetal., 2012; Wangetal., 2012；Scottetal., 2013)?？顾幮缘漠a(chǎn)生將導(dǎo)致家蠅化學(xué)防治的困難甚至失敗，因此開(kāi)展抗藥性的監(jiān)測(cè)和抗性機(jī)制的研究對(duì)于殺蟲(chóng)劑的選用具有重要的意義。

家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的抗性主要有兩大類(lèi)機(jī)制，即細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的代謝解毒作用增強(qiáng)以及靶標(biāo)(鈉離子通道)不敏感性(Scottetal., 2017)。擬除蟲(chóng)菊酯抗性家蠅的鈉離子通道通常存在1014位點(diǎn)的氨基酸替換，即由野生型(敏感型)的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?L1014F)或組氨酸(L1014H)。隨著殺蟲(chóng)劑選擇壓的增加，家蠅可能進(jìn)化產(chǎn)生多位點(diǎn)突變的抗性等位基因，如1014和918雙位點(diǎn)突變(M918T+L1014F)。近年來(lái)，在美國(guó)采集的家蠅中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)抗性相關(guān)的新突變即D600N 和T929I，并鑒定了兩個(gè)新的抗性等位基因，即D600N+M918T+L1014F三位點(diǎn)突變型和T929I+L1014F雙位點(diǎn)突變型,該兩等位基因相對(duì)于以往發(fā)現(xiàn)的M918T+L1014F和L1014F抗性等位基因可以導(dǎo)致水平更高、更廣譜的抗藥性(Kasaietal.,2017；Sunetal., 2017)。

家蠅基因組中有146個(gè)P450基因(Scottetal., 2014)，文獻(xiàn)報(bào)道的在某些擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)抗性品系中超量表達(dá)的細(xì)胞色素P450基因包括CYP6D1v1、CYP6D3、CYP6D8、CYP6A5v1、CYP6A5v2、CYP6A36、CYP6A40、CYP6G4(Zhuetal., 2008a; Zhuetal., 2008b; Gaoetal., 2012；Scottetal.，2017)，其中CYP6D1v1被證明可以代謝解毒菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑(Wheelocketal., 1992)。由于P450介導(dǎo)抗性存在進(jìn)化可塑性，不同家蠅種群導(dǎo)致抗性的P450種類(lèi)可能不同(Scottetal., 2004)，加上P450種類(lèi)多樣，且是膜結(jié)合蛋白，其功能鑒定在技術(shù)上困難很大，至今人們對(duì)P450介導(dǎo)的代謝抗性機(jī)制的認(rèn)識(shí)還非常有限(Scottetal.，2017)。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室經(jīng)溴氰菊酯汰選出的高抗性家蠅品系中發(fā)現(xiàn)鈉離子通道M918T和L1014F突變的存在(Qiuetal., 2007)，而在我國(guó)家蠅的野生種群中未檢測(cè)到鈉離子通道M918T突變,卻發(fā)現(xiàn)L1014H是在我國(guó)家蠅中廣泛分布的抗性突變類(lèi)型(Wangetal., 2012)。細(xì)胞色素P450抗性等位基因CYP6D1v1 在我國(guó)野生家蠅種群中也存在(Wangetal., 2012), 但其單獨(dú)存在時(shí)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯抗性的貢獻(xiàn)不大(Panetal., 2018)。為更全面深入地揭示家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯抗性的分子基礎(chǔ)，本文分析了從山東濟(jì)南采集的家蠅對(duì)常用殺蟲(chóng)劑氯菊酯的抗性狀況與抗性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 家蠅品系

本研究涉及到4個(gè)家蠅品系，WHO敏感品系從丹麥Michael Kristensen博士實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)。TJS品系是實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存的殺蟲(chóng)劑敏感品系，自1982年采集在實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)，未接觸過(guò)殺蟲(chóng)劑。濟(jì)南品系(JN)是2009年夏天從山東濟(jì)南的一個(gè)垃圾場(chǎng)采集的野外種群，濟(jì)南-Sel(JN-Sel)是從JN品系經(jīng)用氯菊酯連續(xù)汰選(死亡率平均在60%左右)7代后抗性水平更高的品系。

1.2 主要試劑和儀器

總RNA采用Trizol試劑提取。用于定量PCR的cDNA合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)，熒光定量PCR采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒(天根公司)。其他主要試劑包括Hpy188Ⅲ、MlucI、EcoRI限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，rTaq聚合酶、Primer STAR高保真聚合酶(TaKaRa)，RNaseA(天根公司)。氯菊酯(95%)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心孟鳳霞研究員惠贈(zèng)。熒光定量PCR采用Mx3000P qPCR和3005P qPCR系統(tǒng)(Stratagene), 使用的PCR擴(kuò)增儀為T(mén) 100TM Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)。

1.3 家蠅品系汰選方法

對(duì)羽化后2 d的成蟲(chóng)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的毒力測(cè)定結(jié)果，配制殺死種群約60%個(gè)體的劑量，采用點(diǎn)滴法進(jìn)行處理，24 h后，將存活的家蠅轉(zhuǎn)移到干凈的養(yǎng)蟲(chóng)籠中繼續(xù)傳代飼養(yǎng)，保證每次用于傳代的家蠅總數(shù)在100頭以上。

1.4 家蠅對(duì)氯菊酯敏感性測(cè)定

藥劑濃度現(xiàn)用現(xiàn)配，由母液用丙酮稀釋?zhuān)O(shè)立5個(gè)濃度。選取羽化后第3～5 d大小一致的雌蟲(chóng)，體重在18 mg左右。藥液滴在雌蠅中胸背板中央，每頭滴1 μL，低濃度向高濃度點(diǎn)滴，每一個(gè)濃度點(diǎn)滴30只，每個(gè)濃度重復(fù)3次，以不含藥的丙酮做對(duì)照。藥劑處理過(guò)的家蠅置塑料杯中放在人工氣候箱中正常飼養(yǎng)，設(shè)置溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為65%。24 h后檢查死亡率，用軟件Poloplus計(jì)算死亡率機(jī)率-劑量回歸方程的斜率值(b)、致死中劑量(LD50)及其95%的置信區(qū)間。

1.5 核酸提取與cDNA合成

單頭家蠅基因組DNA的提取采用文獻(xiàn)(Rinkevichetal.,2006)的方法，總RNA提取以及cDNA合成按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 鈉離子通道1014位點(diǎn)基因分型

采用Qiu等(2012)建立的PCR-RFLP方法，通過(guò)綜合分析兩個(gè)不同的PCR反應(yīng)和對(duì)應(yīng)的兩個(gè)不同限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)(反應(yīng)A,反應(yīng)B)產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜來(lái)判斷家蠅樣品的基因型。反應(yīng)A產(chǎn)物的電泳圖如果顯示156 bp一條帶，基因型為L(zhǎng)L、HH或HL；如顯示3條帶(59、96和156 bp)，基因型為FL或HF；如顯示兩條帶(59和96 bp)則為FF。反應(yīng)B電泳圖如顯示為220 bp的一條帶，該樣品基因型為L(zhǎng)L、FF或FL；如顯示三條帶(50、170和220 bp)為HL或HF型；如顯示兩條帶(50和170 bp)則為 HH型。

1.7 P450基因表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量法(RT-qPCR)檢測(cè)4個(gè)品系8個(gè)P450基因(目標(biāo)基因)的表達(dá)量, 以 Actin和RPS3為內(nèi)參基因。每個(gè)品系做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)采用10頭家蠅腹部提取RNA。目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的PCR引物的核苷酸序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL, 正反向引物各0.6 μL(終濃度0.3 μmol/L), cDNA 4 μL(80 ng), 50×ROX Reference Dye 0.4 μL,用無(wú)RNase酶的水補(bǔ)齊至20 μL。PCR條件為95 ℃ 15 min預(yù)變性，40循環(huán)95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s，然后95 ℃ 1 min，55 ℃，30 s，接著逐步升溫到95 ℃，在升溫過(guò)程中記錄熒光信號(hào)值。儀器記錄各個(gè)樣品得到的Ct值、產(chǎn)物熔解曲線。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù),用ddH2O代替cDNA模板作為空白對(duì)照。目標(biāo)基因相對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)量(即相對(duì)表達(dá)量)采用2-ΔCt方法計(jì)算，品系之間的目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量值采用單因素方差分析(ANOVA)和 LSD方法進(jìn)行多重比較, 用不同字母來(lái)表示品系間的差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。

表1 熒光定量 PCR引物

2 結(jié)果

2.1 不同品系家蠅對(duì)氯菊酯的敏感性

4個(gè)檢測(cè)的家蠅品系對(duì)氯菊酯的敏感性見(jiàn)表2。從表2可以看到WHO 與TJS品系沒(méi)有顯著差別，而濟(jì)南品系相對(duì)WHO 品系表現(xiàn)出近50倍的抗性。經(jīng)用氯菊酯汰選7代后的JN-Sel品系獲得了比JN更高水平的抗性，相對(duì)WHO品系抗性倍數(shù)超過(guò)100倍。

表2 四個(gè)家蠅品系對(duì)氯菊酯敏感性

2.2 鈉離子通道1014位點(diǎn)基因型檢測(cè)

為查明抗性品系是否存在1014位點(diǎn)突變介導(dǎo)的擊倒抗性機(jī)制，采用RFLP的方法檢測(cè)鈉離子通道1014位點(diǎn)基因型。在檢測(cè)的濟(jì)南(48頭)和濟(jì)南_Sel品系(63頭)家蠅的RFLP圖譜可以看到，酶切反應(yīng)A(圖1-A)的條帶為156 bp, 酶切反應(yīng)B(圖1-B)的條帶220 bp，表明這些家蠅鈉離子通道的基因型為1014LL 純合型。

圖1 家蠅鈉離子通道基因1014位點(diǎn)基因型檢測(cè)代表性結(jié)果

2.3 不同品系家蠅8個(gè)細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)分析

用Real-time PCR方法，對(duì)4個(gè)品系中的可能與擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性相關(guān)的8個(gè)P450基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。圖2顯示，不同基因在不同品系家蠅中的表達(dá)是有差異的，整體來(lái)看，CYP6G4 和CYP6D1的表達(dá)豐度較高，而CYP6A36、CYP6A40和 CYP6D3的表達(dá)豐度低；CYP6A40在WHO品系中有更高的表達(dá)，CYP6A5v1、CYP6A5v2和CYP6D1在JN抗性品系、CYP6D8和CYP6G4在高抗性JN-Sel品系中表達(dá)量最高。相對(duì)于兩個(gè)敏感品系，在兩抗性品系中都過(guò)量表達(dá)的P450基因有CYP6A5v2、CYP6A36和CYP6G4。兩個(gè)遺傳背景相同的抗性品系比較，CYP6D8和CYP6G4在JN-Sel品系中表達(dá)量更高，但JN品系CYP6D8的表達(dá)量與TJS敏感品系沒(méi)有統(tǒng)計(jì)差異。CYP6G4在兩個(gè)敏感品系中的表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)意義的差異，但在兩個(gè)抗性品系中CYP6G4的表達(dá)量比敏感品系高很多，其中JN品系CYP6G4的表達(dá)量是敏感品系的35倍左右，而在高抗性的JN-Sel品系中的表達(dá)量是敏感品系的70倍。

圖2 八個(gè)P450基因在不同家蠅品系中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑是家蠅化學(xué)控制的主要藥劑，在殺蟲(chóng)劑的選擇壓下家蠅在理論上會(huì)產(chǎn)生抗藥性。敏感性測(cè)定結(jié)果顯示山東濟(jì)南的野生種群已表現(xiàn)出較高水平的氯菊酯抗性，在進(jìn)一步接觸殺蟲(chóng)劑的情況下，抗性繼續(xù)上升，達(dá)到高抗性水平(表2)。

昆蟲(chóng)抗藥性的機(jī)制可能因藥劑類(lèi)型、昆蟲(chóng)種類(lèi)或同種昆蟲(chóng)不同種群的不同而不同。家蠅對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯的抗性的通常機(jī)制是細(xì)胞色素P450的過(guò)量表達(dá)和/或鈉離子通道基因突變。盡管鈉離子通道1014位點(diǎn)的突變?cè)谖覈?guó)抗性家蠅種群中普遍存在，但也有例外(Wangetal., 2012)。通過(guò)對(duì)濟(jì)南(48頭)和濟(jì)南_Sel 品系(63頭)家蠅的鈉離子通道的基因型檢測(cè)，未檢測(cè)到經(jīng)典的L1014F或L1014H 抗性等位基因的存在(圖1),表明鈉離子通道1014位點(diǎn)突變不是JN和JN-Sel品系對(duì)氯菊酯抗性的原因。

通過(guò)對(duì)4個(gè)抗性水平不同的家蠅品系(WHO, TJS,JN和JN-Sel)中8個(gè)P450基因的mRNA水平的定量分析發(fā)現(xiàn)，不同P450基因在不同品系中的表達(dá)量存在差異(圖2)，其中CYP6G4的mRNA水平在抗性品系中顯著高于敏感品系的表達(dá)量，且抗性水平越高的品系，CYP6G4的表達(dá)量也更高。在檢測(cè)的8個(gè)基因中，只有CYP6G4的表達(dá)量與氯菊酯抗性正相關(guān)，加上該基因在家蠅中的表達(dá)豐度相對(duì)較高，我們推測(cè)CYP6G4過(guò)量表達(dá)是JN和JN-Sel品系家蠅抗藥性的主要機(jī)制。

CYP6G4在我國(guó)的抗性家蠅品系或種群中普遍超量表達(dá)，提示CYP6G4很可能在我國(guó)家蠅抗性進(jìn)化中發(fā)揮著重要作用(Gaoetal., 2012)。家蠅CYP6G4與果蠅的Cyp6g1遺傳進(jìn)化距離最近，其氨基酸相似性達(dá)到了59.70%，由此推測(cè) CYP6G4是果蠅Cyp6g1的直系同源基因。果蠅Cyp6g1過(guò)量表達(dá)已被證明可以導(dǎo)致果蠅對(duì)DDT和煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性(Dabornetal., 2001；2002；Jou?enetal., 2008)。CYP6G4在新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑抗性品系中比敏感品系高(H?jlandetal., 2014；H?jlandetal., 2017)，被認(rèn)為是家蠅對(duì)新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑主要抗性基因(H?jlandetal., 2014)。前人的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)以及本研究的研究結(jié)果提示CYP6G4過(guò)量表達(dá)可能導(dǎo)致對(duì)多個(gè)類(lèi)型殺蟲(chóng)劑(如擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)、新煙堿類(lèi))的抗藥性(即交互抗藥性)，值得研究人員和家蠅防治工作者的重視。