施春波 董長(zhǎng)征 陳磊 翁磊

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見(jiàn)的亞型，其組織學(xué)亞型又以肺腺癌多見(jiàn)。目前關(guān)于肺腺癌治療與預(yù)后評(píng)估主要依據(jù)TNM分期，而手術(shù)切除是早期肺腺癌的治療手段[2]；雖然手術(shù)切除可以提高生存率，但是仍有近1/4的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3-4]。因此，準(zhǔn)確評(píng)估肺腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。免疫反應(yīng)是許多特異性細(xì)胞之間相互協(xié)調(diào)的過(guò)程，對(duì)肺腺癌臨床結(jié)局可造成一定的影響[5]。據(jù)報(bào)道，腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞（簡(jiǎn)稱免疫細(xì)胞）的功能和組成會(huì)隨著宿主免疫狀態(tài)變化而改變，并可能成為特定藥物的有效靶點(diǎn)。CIBERSORT（通過(guò)估計(jì)RNA轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)亞群來(lái)識(shí)別細(xì)胞類型）是一種基于基因表達(dá)的反卷積算法，利用一組條形碼基因表達(dá)值來(lái)表示免疫細(xì)胞組成。與傳統(tǒng)的免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等試驗(yàn)方法相比，CIBERSORT能全面、快速、準(zhǔn)確地推斷22種免疫細(xì)胞在腫瘤中的相對(duì)浸潤(rùn)比例[6]。近年來(lái)有不少研究采用該方法探討22種免疫細(xì)胞對(duì)預(yù)后的影響[7-9]。本研究利用CIBERSORT計(jì)算肺腺癌中22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例，并構(gòu)建免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型及列線圖來(lái)預(yù)測(cè)肺腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)獲取 本研究肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA[10]。通過(guò)UCSC Xena網(wǎng)站（https://xenabrowser.net/）輸入關(guān)鍵詞“肺腺癌”下載TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中594例肺腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括正常肺組織樣本59例,肺腺癌組織樣本535例。同時(shí)獲取523例肺腺癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、TNM分期、預(yù)后等。最后利用R軟件的limma包對(duì)下載的肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

1.2 腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)評(píng)估 利用CIBERSORT軟件對(duì)校正后的肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中22種免疫細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)比例進(jìn)行推算。首先，將校正后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT網(wǎng)站（http://cibersort.stanford.edu/），將算法設(shè)置為1 000排。數(shù)據(jù)集中每個(gè)樣本將會(huì)得到一個(gè)P值，最終篩選出P＜0.05的樣本作進(jìn)一步研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0和R 3.5.3統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量比較，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；呈偏態(tài)分布的連續(xù)變量比較，采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較不同復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)患者的總生存率。繪制ROC曲線分析復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)模型的診斷效能。單因素Cox回歸模型用于分析單個(gè)變量對(duì)生存的影響，多因素Cox回歸模型用于分析與生存相關(guān)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，利用Cox回歸模型分析中的回歸系數(shù)構(gòu)建列線圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 22種免疫細(xì)胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的差異表達(dá) 利用CIBERSORT篩選出517例P＜0.05的樣本進(jìn)行研究，其中正常肺組織樣本56例，肺腺癌組織樣本461例。對(duì)22種免疫細(xì)胞在正常肺組織、肺腺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示除CD8+T細(xì)胞、幼稚的CD4+T細(xì)胞、激活的自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）及激活的肥大細(xì)胞外，其余免疫細(xì)胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1a（插頁(yè)）。主成分分析結(jié)果顯示，正常肺組織與肺腺癌組織的免疫浸潤(rùn)情況有明顯的組偏聚類和個(gè)體差異，見(jiàn)圖1b（插頁(yè)）。

圖1 腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的差異表達(dá)（a：小提琴圖，藍(lán)色代表正常肺組織，紅色代表肺腺癌組織，NK細(xì)胞為自然殺傷細(xì)胞；b：主成分分析圖，紅色代表正常肺組織，綠色代表肺腺癌組織）

圖2 免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型（a：Kaplan-Meier生存曲線；b：ROC曲線；c：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分；d：生存狀態(tài)；e：免疫浸潤(rùn)模式）

2.2 22種免疫細(xì)胞對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響 利用單因素Cox回歸模型對(duì)22種免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，以尋找與肺腺癌總生存有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的預(yù)后亞群。結(jié)果顯示嗜酸性粒細(xì)胞（HR=4.08E+17，95%CI：1 560.24～1.07E+32，P＜0.05）、激活的樹(shù)突狀細(xì)胞（HR=79.44，95%CI：1.54～4 107.17，P＜0.05）、M1 型巨噬細(xì)胞（HR=30.42，95%CI：1.24～747.63，P＜0.05）均與肺腺癌預(yù)后較差有關(guān)，見(jiàn)表1。

2.3 基于3種免疫細(xì)胞的免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型構(gòu)建與評(píng)價(jià) 假設(shè)上述單因素Cox回歸分析篩選的3種免疫細(xì)胞對(duì)肺腺癌的總體生存有影響，將這3種免疫細(xì)胞作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)測(cè)信號(hào)來(lái)預(yù)測(cè)患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。采用多因素Cox回歸法對(duì)這3種免疫細(xì)胞構(gòu)建免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。根據(jù)模型對(duì)每例患者進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，按風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位值將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組，Kaplan-Meier曲線提示高風(fēng)險(xiǎn)組患者總生存率低于低風(fēng)險(xiǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2a（插頁(yè)）。ROC曲線顯示，該風(fēng)險(xiǎn)模型在預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面具有較好的診斷效能（AUC=0.60），見(jiàn)圖2b（插頁(yè)）。肺腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、生存狀態(tài)及免疫浸潤(rùn)模式見(jiàn)圖2c-e（插頁(yè)）。

表1 22種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞對(duì)肺腺癌患者預(yù)后的影響

2.4 免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)肺腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值 為探索構(gòu)建的免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型對(duì)肺腺癌預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)是否獨(dú)立于患者年齡、性別、TNM分期等臨床病理參數(shù)，筆者對(duì)免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、性別、TNM分期進(jìn)行了多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型（HR=1.30，95%CI：1.20～1.40，P＜0.05）、TNM 分期（HR=1.70，95%CI：1.49～2.10，P＜0.05）是肺腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

2.5 預(yù)測(cè)肺腺癌患者生存率的列線圖構(gòu)建 建成的預(yù)測(cè)肺腺癌患者生存率的列線圖見(jiàn)圖3。

3 討論

除惡性腫瘤細(xì)胞外，癌組織還包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及大量細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子。這些組件及它們之間的相互作用構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境對(duì)惡性細(xì)胞具有抑制作用，但是腫瘤細(xì)胞在進(jìn)展過(guò)程中會(huì)避開(kāi)這些抑制性信號(hào)，利用免疫細(xì)胞及其他有利條件促進(jìn)自身的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移[11]。眾所周知，在免疫細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)中的惡性細(xì)胞之間，事實(shí)上存在著復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，且具有明顯的預(yù)后相關(guān)性。例如在結(jié)直腸癌患者中，M1型巨噬細(xì)胞及激活的樹(shù)突狀細(xì)胞與較好的預(yù)后相關(guān)，而M2型巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞與預(yù)后不良相關(guān)[12]。Zhou等[9]基于免疫細(xì)胞構(gòu)建了預(yù)后免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，該模型是結(jié)腸癌患者無(wú)復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，且較TNM分期有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

圖3 預(yù)測(cè)肺腺癌患者生存率的列線圖

手術(shù)切除后腫瘤復(fù)發(fā)是影響肺腺癌患者總生存的重要因素之一。因此，準(zhǔn)確評(píng)估患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于肺腺癌患者總生存的改善至關(guān)重要。為了全面探索免疫細(xì)胞預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后的價(jià)值，筆者采用CIBERSORT對(duì)肺腺癌組織中22種免疫細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)比例進(jìn)行推算，并選取P＜0.05的樣本用于研究。單因素Cox回歸分析顯示，嗜酸性粒細(xì)胞、激活的樹(shù)突狀細(xì)胞及M1型巨噬細(xì)胞均與肺腺癌患者較差的預(yù)后相關(guān)。基于這3種免疫細(xì)胞，筆者采用多因素Cox回歸模型構(gòu)建了免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，而ROC曲線分析顯示該模型預(yù)測(cè)肺腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)是可靠的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、濾泡輔助T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞等對(duì)肺腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值雖然不大，但是在正常肺組織與肺腺癌組織中存在差異表達(dá)，表明這些細(xì)胞與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，本研究證明了免疫細(xì)胞在肺腺癌預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，本文基于3種免疫細(xì)胞構(gòu)建的免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型是肺腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。但本研究不可避免地存在一定的局限性：（1）公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)集中發(fā)布的數(shù)據(jù)量有限，本研究用于分析的臨床病理參數(shù)不全面，可能導(dǎo)致潛在的錯(cuò)誤或偏倚；（2）未考慮與免疫浸潤(rùn)位置相關(guān)的免疫微環(huán)境的異質(zhì)性；（3）為構(gòu)建免疫風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型而下載的所有數(shù)據(jù)均來(lái)自西方國(guó)家，因此該研究成果在亞洲國(guó)家患者身上不一定適用，需要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。