楊釗 康文巖 劉軍

帕金森病(PD)是最常見的神經(jīng)變性病之一，臨床表現(xiàn)可分為運動癥狀與非運動癥狀(NMS)[1]。 因其起病隱匿、臨床表現(xiàn)復雜、缺乏特異性診斷標記物等原因，PD 早期診斷與鑒別診斷的研究進展較為緩慢[2]。隨著蛋白質(zhì)組學、基因組學、代謝組學等技術(shù)的出現(xiàn)，唾液已成為研究生化標記物的熱點標本來源[3-4]。DJ-1是一種由189 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其所發(fā)揮的抑制α-突觸核蛋白(α-syn)形成低聚物的作用是PD 病理學的關(guān)鍵部分。 DJ-1 突變可導致早發(fā)家族性常染色體隱性PD。 我們之前的研究結(jié)果提示唾液DJ-1是評價PD 患者黑質(zhì)紋狀體多巴胺(DA)功能的潛在標記物[5]。 既往的研究表明NMS 可能在運動癥狀出現(xiàn)之前即已存在[6]，而目前關(guān)于PD 患者唾液DJ-1蛋白水平與NMS 及唾液α-syn 的相關(guān)性研究尚少，因此我們通過比較原發(fā)性PD 患者唾液DJ-1 水平與NMS、唾液α-syn 水平的相關(guān)性，旨在探討其在PD診斷中的潛在價值。

對象與方法

1.對象：2011 年 3 月 ～ 2012 年 12 月于我科門診確診的原發(fā)性PD 患者81 例(PD 組)，其中男49 例，女32 例，平均年齡(63.49 ±9.45)歲，均符合英國腦庫PD 診斷標準[7]，排除各種原因所致的帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征及經(jīng)過功能神經(jīng)外科治療的PD患者。 招募年齡和性別與PD 組患者相匹配的社區(qū)人群65 例作為對照組，其中男41 例，女24 例，平均年齡(61.25 ±10.08)歲，無帕金森綜合征、認知障礙或其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史，且無任何跡象和癥狀。 排除標準：中度或重度吸煙(超過10 包/年)、飲酒和使用任何心理治療藥物。 本研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)NMS 評估：采用簡易智能精神狀態(tài)檢查量表(MMSE)[8]、17 項漢密爾頓抑郁量表(HAMD-17)[9]、快速眼動睡眠行為障礙篩查問卷(RBDSQ)、16 項氣味辨認測試(SS-16)、羅馬Ⅲ便秘標準對NMS 進行評定。 RBDSQ 用于篩選可能的臨床快速眼動期睡眠障礙(cpRBD)，共計 15 分，評分≥6 分為陽性；SS-16 用于評估嗅覺功能，評分≤8 分為存在嗅覺障礙[10-11]；HAMD-17 用于評估患者情緒，評分＜7 分為正常；羅馬Ⅲ便秘標準用于評估慢性便秘[12]。

(2)唾液的采集與處理：唾液樣本收集步驟參考文獻[5]和[11]，患者唾液采集前1 h 內(nèi)禁食水(上午9 ～11 時)，安靜房間內(nèi)靜坐10 min(不能有食物和咀嚼物的刺激)后收集3 ml 左右唾液。 收集完成后將盛有唾液的離心管立刻置于冰上，每900 μl 唾液加入蛋白酶抑制劑 cocktail(美國 Sigma 公司)100 μl，使用Vortex 混勻后低溫 4 ℃、2 600 g 離心 15 min，棄掉沉淀，再次4 ℃、15 000g 離心15 min，然后將上清液每500 μl 分裝至 EP 管內(nèi)，儲存在 -80 ℃冰箱中待用。使用BCA 試劑盒(美國Pierce 公司)檢測唾液總蛋白濃度。

(3)唾液中DJ-1 與α-syn 蛋白含量的檢測：應(yīng)用Luminex 技術(shù)檢測唾液中DJ-1 蛋白含量，檢測方法參考文獻[5]和[11]。 首先使用Bio-Plex 蛋白微球氨基耦聯(lián)試劑盒(美國Bio-Rad 公司)將C00H 磁珠與DJ-1兔單克隆抗體(Abcam 公司)連接，然后將捕獲抗體加入96 孔Bio-Plex 檢測板，重組的人DJ-1 蛋白(Covance公司)作為標準品，設(shè)置唾液樣本、標準品和空白對照，最后在Liquichip Luminex 200(美國Bio-Rad 公司)上進行相關(guān)參數(shù)的設(shè)置并對96 孔板上的標準品及樣品中的DJ-1 蛋白含量進行測定。 唾液DJ-1 蛋白含量指每單位唾液體積所含DJ-1 蛋白總質(zhì)量；唾液DJ-1蛋白相對含量指每單位唾液蛋白質(zhì)量中所含DJ-1 蛋白總質(zhì)量。 唾液α-syn 的檢測方法同前[11]。

3.統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析(ANOVA)；不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P75，P25)表示，組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis方差分析。 計數(shù)資料以例和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。 相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.PD 患者各NMS 量表評分情況：所有PD 患者的SS-16 評分為(8.37 ±2.78)分，伴嗅覺障礙43 例，無嗅覺障礙 38 例；HAMD 評分為(4.72 ±3.84)分，伴抑郁18 例，不伴抑郁 58 例；MMSE 評分為(27.41 ±2.31)分；RBDSQ 評分為(3.52 ± 2.84)分，伴 RBD 18 例，不伴RBD 63 例；此外，35 例 PD 患者伴便秘，46 例患者不伴便秘。

2.PD 組和對照組唾液DJ-1 蛋白水平比較：PD 組患者的唾液 DJ-1 蛋白含量為(4.07 ±6.42)ng/ml，相對含量為(2.91 ±4.12)ng/mg；對照組受試者的唾液DJ-1 蛋白含量為(3. 78 ± 5. 41)ng/ml，相對含量為(3.58 ±5.61)ng/mg。 兩組受試者的唾液 DJ-1 蛋白含量和相對含量比較差異均無統(tǒng)計學意義(分別為P＝0.79 和P＝0.99)。

3.PD 患者唾液DJ-1 蛋白水平與NMS 的相關(guān)性分析結(jié)果：Spearman秩相關(guān)檢驗結(jié)果顯示，唾液DJ-1蛋白水平與 SS-16、HAMD-17、MMSE、RBDSQ 評分無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見表1。 根據(jù)量表評分將PD組分別分為有無嗅覺障礙、RBD、便秘、抑郁亞組，并與對照組進行比較結(jié)果顯示，PD 各NMS 亞組患者的唾液DJ-1 蛋白水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表 2 ～5。

表1 PD 患者唾液DJ-1 蛋白水平與NMS 各量表評分的相關(guān)性分析

表2 PD 患者伴/不伴嗅覺障礙亞組與對照組唾液DJ-1 蛋白水平的比較[M(P25，P75)]

表3 PD 患者伴/不伴RBD 亞組與對照組唾液DJ-1 蛋白水平的比較[M(P25，P75)]

表4 PD 患者伴/不伴便秘亞組與對照組唾液DJ-1 蛋白水平的比較[M(P25，P75)]

表5 PD 患者伴/不伴抑郁亞組與對照組唾液DJ-1 蛋白水平的比較[M(P25，P75)]

3.唾液DJ-1 蛋白與α-syn 的相關(guān)性分析結(jié)果：無論在PD 組還是對照組，唾液DJ-1 蛋白水平與α-syn含量均呈輕度負相關(guān)(P＜0.05)，而與α-syn 相對含量無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，見表6。

表6 唾液DJ-1 與α-syn 水平的相關(guān)性分析結(jié)果

討 論

PD 起病隱匿，在患者出現(xiàn)明顯的運動癥狀前數(shù)年，其黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元已經(jīng)開始損失[13-14]。 因此，PD 的早期診斷、提高診斷準確性、監(jiān)測疾病進展和治療效果等需求尤為迫切，而已有的影像學技術(shù)包括正電子發(fā)射計算機斷層成像(PET)、單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(SPECT)等檢查及一些早期生物學標記物檢測雖然有助于PD 的早期診斷[15]，但由于價格昂貴、放射性大等原因難以在臨床普及。 因收集簡便、成本低廉且無創(chuàng)，唾液可能是發(fā)現(xiàn)PD 生物標記物的理想標本。 野生型DJ-1 是氧化應(yīng)激傳感器和抗氧化劑，同時具有分子伴侶、蛋白酶、乙二醛酶及保護線粒體免受氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用[16]。 在PD 中，DJ-1蛋白通過多種機制保護多巴胺能神經(jīng)元。 既往研究結(jié)果顯示，DJ-1 是腦脊液、血液中PD 的潛在生物標記物[17]。

PD 患者的唾液腺功能可能受到影響，表現(xiàn)為唾液分泌不足和唾液成分異常[18]。 近期一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)PD 患者唾液中總蛋白濃度和DJ-1 濃度均升高，但調(diào)整總蛋白濃度后，唾液中DJ-1 濃度無差異；DJ-1水平與國際運動障礙協(xié)會-統(tǒng)一帕金森病評定量表(MDS-UPDRS)測量的疾病嚴重程度相關(guān)；同時還發(fā)現(xiàn)PD 患者唾液中淀粉酶、白蛋白等濃度升高，這項研究提示PD 患者自主神經(jīng)功能障礙導致其唾液成分不同于健康對照人群，唾液可能是探索PD 早期診斷的潛在生物標志物儲存庫[3，18-19]。 本研究組既往進行的一項大樣本量隊列研究發(fā)現(xiàn)，雖然唾液DJ-1 不受統(tǒng)一PD 評定量表(UPDRS)評分、性別、年齡和藥物治療的影響，但 H＆Y 4 期 PD 患者的唾液 DJ-1 水平高于H＆Y 1 ～3 期 PD 患者和健康對照組；混合型(MT)PD患者唾液DJ-1 水平也明顯低于震顫型(TDT)和強直型(ARDT)患者，并提示唾液DJ-1 可作為評價PD 患者黑質(zhì)紋狀體多巴胺功能的潛在標記物[5]。

NMS 在PD 的前驅(qū)階段占主導地位，部分NMS 可能作為PD 的臨床生物標志物。 大多數(shù)PD 患者伴有NMS，平均癥狀數(shù)量為 4 ～19 種[20]。 除 DA 能途徑、遺傳或藥物等因素外，常見的NMS 可能涉及其他神經(jīng)遞質(zhì)的異常，如5-羥色胺、去甲腎上腺素、乙酰膽堿、甘氨酸、谷氨酸和 γ-氨基丁酸。 PINK1 基因敲除(KO)大鼠的基礎(chǔ)DA、谷氨酸和乙酰膽堿存在年齡依賴性異常；Parkin-KO 和LRRK2-KO 大鼠的基礎(chǔ)DA 代謝產(chǎn)物均存在年齡依賴性異常；Parkin-KO 大鼠的甘氨酸釋放量增加；DJ-1-KO 大鼠的谷氨酸釋放量減少，乙酰膽堿釋放量增加[20-21]。 NMS 的臨床評估方法包括國際運動障礙學會和其他國際組織推薦的各種量表[20]。既往研究結(jié)果顯示，唾液α-syn 含量與NMS 各量表評分無明顯關(guān)聯(lián)[11]，本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)唾液DJ-1水平與 MMSE、HAMD、RBDSQ 等 NMS 量表評分同樣無明顯相關(guān)性。 根據(jù)不同的NMS，我們將PD 分為是否伴嗅覺障礙、便秘、RBD、抑郁等亞組[6，14]，并與對照組比較，仍未發(fā)現(xiàn)唾液DJ-1 水平有明顯差異。 或許PD 需要進一步的隊列研究來確定這些亞型的具體臨床特征以及生物標記物。 PD 可能是一種不同的、特定的神經(jīng)遞質(zhì)缺陷導致一系列復雜的、相關(guān)的綜合征，故Titova 等提出了一種更為相關(guān)的基于神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙的NMS 亞組分類的觀點，并得到了影像學和其他生物標志物研究的支持[20，22]。

我們之前的研究顯示唾液α-syn 水平可以通過不同的α-syn 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)來控制，唾液寡聚型α-syn 可能是PD 的潛在診斷指標，但PD 組與對照組總α-syn 水平差異無統(tǒng)計學意義，且與NMS 無明顯相關(guān)性[11，23]。 目前唾液 DJ-1 與 α-syn 水平的相關(guān)性尚缺乏研究，而我們分析發(fā)現(xiàn)無論在對照組還是PD組，唾液DJ-1 與總α-syn 水平均呈負相關(guān)，提示唾液蛋白水平變化可能反映唾液腺的病理變化，但其臨床意義仍需進一步探索研究[24-25]。

由于現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)的缺乏和不同研究結(jié)果相互矛盾，目前在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的檢測和監(jiān)測中，唾液生物標記物缺乏可靠性。 如采用非侵入性篩選技術(shù)，則需要不斷加大研究力度，同時標準化唾液收集、處理及檢測流程以減少偏差。 此外，唾液生物標記物在PD 的早期階段，不能簡單地代替其他侵入性檢查，但可以作為輔助診斷的手段。 而研究PD 相關(guān)的突觸功能障礙和神經(jīng)遞質(zhì)動力學，以及研究這些PD 相關(guān)突變基因的正常功能和致病機制及其與NMS 的相關(guān)性，對于篩選體液中的生物標記物具有積極的指導意義。