聞東明, 黃羅冬, 楊青山, 申佩弘

廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004

甲基營養(yǎng)菌(Methylobacteriumsp.)是一類能夠利用單碳化合物或非C—C鍵低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛等)的微生物，由于這類細(xì)菌多為桿狀，也稱為甲基桿菌(Methylotrophicbacteria)[1]。其在自然界中分布廣泛，早在20世紀(jì)初科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了有細(xì)菌存在甲基營養(yǎng)能力，但直到20世紀(jì)六、七十年代，它們的生理生化性質(zhì)才逐漸引起研究者的重視[2]。研究報(bào)道共有100多個(gè)基因參與甲基營養(yǎng)菌的C1代謝過程，包括甲醇氧化、甲胺氧化、甲醛氧化和絲氨酸循環(huán)等[3]。

目前，利用微生物合成方法生產(chǎn)生物燃料、精細(xì)化學(xué)品和藥物分子等 (如: 烴類燃料、大宗有機(jī)酸等) 主要使用葡萄糖作為碳源與能源，存在與人畜爭糧爭地的困局[4]。甲醇作為簡單的甲基化合物，含有更多電子，可提供更多還原力，且市場價(jià)格低廉，不受季節(jié)與氣候的影響[5]，同時(shí)也是很多工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)物及廢棄物的主要成分，因而使用甲基營養(yǎng)菌生物合成途徑具有明顯的優(yōu)勢。如果能夠根據(jù)甲基營養(yǎng)菌的這一特性對(duì)其加以利用，不僅可以降低污染，節(jié)約能源，還可以開辟出一條蛋白質(zhì)或其它生物資源開發(fā)的新路徑[5]。目前已有研究利用其生產(chǎn)氨基酸、單細(xì)胞蛋白、聚合物、胞外多糖、維生素和輔酶等物質(zhì)[6]。

甲醇作為底物具有很多優(yōu)點(diǎn)，但也存在如下關(guān)鍵問題：(1)具有毒性的甲醇在甲基營養(yǎng)型微生物培養(yǎng)過程中不易染菌，但甲醇代謝過程中產(chǎn)生的甲醛對(duì)細(xì)胞有毒害作用[7];甲醇濃度高或濃度波動(dòng)大均會(huì)造成甲醛在細(xì)胞中大量積累，對(duì)細(xì)胞造成毒害;(2)作為菌株生長的唯一碳源，甲醇濃度低定會(huì)造成產(chǎn)量低，而過高的甲醇濃度會(huì)對(duì)菌株造成傷害，甚至導(dǎo)致菌株無法生長;(3)在以甲醇作為底物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，存在培養(yǎng)過程穩(wěn)定性差的問題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)[8]。

MutL基因是M. sp. MB200體內(nèi)的一個(gè)突變修復(fù)基因，在大腸桿菌中，DNA復(fù)制錯(cuò)誤主要通過甲基導(dǎo)向錯(cuò)配修復(fù)(MMR)途徑進(jìn)行糾正[9]。MutL蛋白通過調(diào)節(jié)從錯(cuò)配識(shí)別到DNA雙鏈體解旋展開的一系列事件中發(fā)揮核心作用[10]。MMR首先通過需要ATP的MutS二聚體識(shí)別異常堿基對(duì)，隨后MutL以ATP結(jié)合的形式與MutS-DNA復(fù)合物[11]相互作用，激活與MutH 相關(guān)的潛在內(nèi)切酶，定位在不匹配的兩側(cè)[12]。接著，MutL將UvrD蛋白招募到帶缺口的DNA底物上，啟動(dòng)DNA從切口展開。解開的新生DNA鏈被細(xì)胞核酸外切酶[13]，產(chǎn)生一個(gè)缺口，然后由DNA聚合酶III填補(bǔ)，最后的缺口被DNA連接酶封閉[14]。

目前少有關(guān)于甲基營養(yǎng)微生物耐受甲醇方面的報(bào)道，其耐受甲醇機(jī)理尚不清楚，因此獲得高耐受甲醇的甲醇營養(yǎng)型微生物對(duì)工業(yè)生產(chǎn)和解析其耐受甲醇的機(jī)理具有重要意義。

本研究從本實(shí)驗(yàn)室保存的一株甲基營養(yǎng)菌M. sp. MB200野生菌株出發(fā)，通過三親本結(jié)合構(gòu)建突變修復(fù)基因Mutl插入的突變體，在甲醇濃度不斷提高的環(huán)境中對(duì)MB200mTB進(jìn)行不斷地甲醇環(huán)境壓力脅迫誘導(dǎo)突變，篩選獲得高甲醇條件下生長的菌株，為進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株M. sp. MB200(Nmr)和大腸桿菌E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存，所用質(zhì)粒為pMD18-T(Ampr，TaKaRa公司)、pk18mod(Kmr)、pRK2073(Kmr)、pCM80(Tcr)。

1.1.2培養(yǎng)基

(1) 完全培養(yǎng)基(CM,g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.0。

(2) 基本培養(yǎng)基(MM，g/L)按照文獻(xiàn)[15]配制，在培養(yǎng)甲基營養(yǎng)菌M. sp. MB200時(shí)在實(shí)驗(yàn)前向培養(yǎng)基中加入無水甲醇。

1.1.3常用抗生素及使用濃度

氨芐青霉素(Amp,50 μg/mL)、卡那霉素(Km,25 μg/mL)、四環(huán)素(Tc,25 μg/mL)、萘啶酮酸(Nm,50 μg/mL)。LA Taq聚合酶和T4-DNA連接酶購自TaKaRa公司。

1.1.4主要試劑

所需化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和膠回收試劑盒等常用試劑盒購自Thermo公司。其他生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)常用試劑購自上海生工公司。本實(shí)驗(yàn)所用引物也交由上海生工合成，所用引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2 方法

1.2.1M. sp. MB200和突變菌株

MB200mTB基因組DNA提取、質(zhì)粒DNA提取、回收、純化、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學(xué)操作均參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.2.2mutL基因和部分mutL片段(mutLps)的PCR擴(kuò)增和DNA測序

參照Genbank中AM1的mutL基因序列，通過vector NTI軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列分別為MutL-F:5′-CCCAAGCTTACGAGGTGTGAGGATAGCGG-3′,MutL-R:5′-AACTGCAGGCGAGTCTGTATCGGTTCCC-3′,MutL-P1:5′-C-CCCTGCAGACCTCGAAGCTCCCCGAC-3′,MutL-P2:5′-AAAAGCTTCTCCGGCTCG-GGCCGAAGG-3′。以M. sp. MB200的基因組DNA為模板，其中MutL-F和MutL-R用來擴(kuò)增完整mutL基因序列，MutL-P1和MutL-P2用來擴(kuò)增mutL基因內(nèi)的部分片段mutLps。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T vector載體上(分別命名為pMD18T-MutL,pMD18T-MutLps)，分別導(dǎo)入DH5α，在含有X-gal、IPTG和Amp的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并提取質(zhì)粒，酶切和測序驗(yàn)證。

1.2.3原始菌株M. sp MB200的耐甲醇性

將M. sp. MB200種子液5 mL接入甲醇濃度分別為0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%和2.2%的100 mL MM培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床32 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，測量原始菌株在不同甲醇中的生長曲線。

1.2.4MutL基因突變株MB200mTB的構(gòu)建

將mutL片段(mutLps)用PstI與Hind III從T載體上酶切下，與同樣用PstI與Hind III酶切的pK18mob載體連接,得到重組質(zhì)粒pK18mob-mutLps，化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中。在質(zhì)粒載體pK18mob的多克隆位點(diǎn)上游200 bp處設(shè)計(jì)引物P3:5′-GGCCGATTCATTAATGCAGC-3′，以重組質(zhì)粒pK18mob-mutLps為模板，分別以P3、MutL-P1為引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證重組質(zhì)粒pK18mob-mutlps連接的正反向。采用三親本接合的方法[17]，將供體菌DH5α/pK18mob-mutLps，受體菌M. sp MB200，幫助菌DH5α/pRK2073同時(shí)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用0.85%生理鹽水洗滌三次后將3種菌體按照DH5α/pK18mob-mutLps:M. sp. MB200:DH5α/pRK2073=1∶4∶1混合在一起，用移液器轉(zhuǎn)移至含10% LB的MMI培養(yǎng)基的醋酸纖維薄膜上，置于超凈工作臺(tái)中晾干，于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃倒置培養(yǎng)3 d。在此期間，每隔12 h用滅菌牙簽從薄膜的菌落邊緣挑取部分菌落，使用1 mL MM液體培養(yǎng)基于滅菌Ep管中清洗牙簽，將其稀釋涂布于含抗生素Nm 50 μg/mL、Km 25 μg/mL的MMI固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，32 ℃培養(yǎng)72 h。得到的篩選子命名為MB200mTB(Nmr,Kmr)，即為突變株。

1.2.5突變株MB200mTB的耐甲醇誘導(dǎo)

往1.5%甲醇濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接入菌株MB200mTB，于恒溫?fù)u床30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，后接入10%菌液進(jìn)1.7%(甲醇濃度增加0.2%)甲醇濃度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h。待生長穩(wěn)定后繼續(xù)接種10%菌液進(jìn)甲醇濃度增加0.2%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組接種10%菌液進(jìn)甲醇濃度增加1%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。由于突變株MB200mTB的突變修復(fù)基因mutL被插入突變，不能修復(fù)在菌體生長繁育中產(chǎn)生的各種隨機(jī)突變，在甲醇濃度不斷增長的環(huán)境中，只有產(chǎn)生高濃度甲醇耐性的菌株可以存活，其余突變方向的菌株因不能適應(yīng)高濃度甲醇環(huán)境而死亡，經(jīng)過不斷地傳代馴化后，可篩選獲得耐高濃度甲醇的菌株。

1.2.6表達(dá)載體pCM80-mutL的構(gòu)建

使用分別含PstI酶切位點(diǎn)和Hind III酶切位點(diǎn)的引物MutL-F和MutL-R，從克隆載體pMD18T-MutL中擴(kuò)增出mutL目的片段，膠回收后進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)同樣酶切處理的載體pCM80連接，構(gòu)建表達(dá)載體pCM80-mutL，化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，篩選獲得的陽性重組子命名為E.coliDH5α/pCM80-mutL。

1.2.7耐高甲醇濃度重組株MB200mHB菌株構(gòu)建

由于MB200mTB的突變修復(fù)基因mutL被插入突變，不能修復(fù)菌體產(chǎn)生的各種隨機(jī)突變，遺傳穩(wěn)定性差，需要將mutL基因回補(bǔ)到篩選到的耐高濃度甲醇菌株中，確保其遺傳的穩(wěn)定性。吸取耐甲醇誘導(dǎo)系統(tǒng)中可在7%甲醇濃度下正常生長的菌液，稀釋后涂板于添加甲醇濃度為7%的MM固體培養(yǎng)基上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)72 h，隨機(jī)挑選20個(gè)單菌落于7%的MM液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的E.coliDH5ɑ/pCM80-mutL做為供體菌，隨機(jī)挑選的20株MB200mTB做為受體菌，E.coliDH5α/pRK2073做為幫助菌，三親本結(jié)合后于32 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d。每隔12 h用滅菌牙簽從薄膜的菌落邊緣挑取部分菌落，稀釋涂布于含抗生素Nm 50 μg/mL、Tc 15 μg/mL的MM固體培養(yǎng)基，倒置于培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)72 h。得到的20株篩選子MB200mTB/pCM80-mutL(Nmr,Tcr)即重組株分別命名為MB200mHB1-MB200mHB20。

1.2.8重組菌株遺傳穩(wěn)定性研究

將得到的20株MB200mHB菌株分別于7%甲醇含量的MM液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床32 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，測量其OD600。 5%接種量接種于7%甲醇含量的MMI液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，32 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h，測量其OD600。連續(xù)傳代10次，記錄每次傳代時(shí)菌株生長狀況，待最后一次傳代時(shí)進(jìn)行平板涂菌培養(yǎng)，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取驗(yàn)證并送交生物公司測序，以確定重組菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.9重組菌株生長情況分析

先分別從培養(yǎng)有野生型菌株M. sp. MB200和重組菌株MB200mHB1的新鮮的平板上接一環(huán)菌株于10 mL指型瓶中活化培養(yǎng)，恒溫?fù)u床32 ℃、200 r/min培養(yǎng)使之達(dá)到對(duì)數(shù)生長后期。按0.5%的接種量將M. sp. MB200和MB200mHB1分別轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的甲醇含量為1%的MM液體培養(yǎng)基中；另將MB200mHB1按0.5%的接種量接入甲醇含量分別為1%和7%的100 mL新鮮的MM液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床32 ℃、200 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每6 h取樣，使用分光光度計(jì)檢測菌液OD600數(shù)值，繪OD600與時(shí)間的曲線圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株M. sp MB200的甲醇耐受

將菌株M. sp MB200種子液5 mL接入100 mL甲醇濃度分別為0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%和2.2%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，32 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng) 48 h，測量原始菌株在不同濃度甲醇中的生長曲線及菌體量(圖1)。 菌株在1%甲醇濃度培養(yǎng)基中生長速度最快，菌體量最大，在甲醇濃度增高的培養(yǎng)基中生長速度及菌體量遞減，在2.2%甲醇濃度培養(yǎng)基中幾乎不進(jìn)行生長。

圖1 菌株MB200的甲醇耐受生長曲線

2.2 突變體的構(gòu)建與篩選

使用自殺質(zhì)粒pK18mob構(gòu)建含有mutL基因部分片段的重組質(zhì)粒pK18mob-mutLps，通過三親本結(jié)合將質(zhì)粒pK18mob-mutLps 導(dǎo)入野生菌株M. sp. MB200中，經(jīng)過同源單交換，mutL基因被pK18mob插入突變。經(jīng)Nm、 Km抗性平板篩選，PCR驗(yàn)證，得到突變株MB200mTB(Nmr,Kmr)。

2.3 菌株MB200mTB的甲醇誘導(dǎo)突變

通過在不斷增加的甲醇濃度對(duì)突變體MB200mTB連續(xù)傳代培養(yǎng)，環(huán)境誘導(dǎo)突變。菌株經(jīng)過若干代培養(yǎng)后，逐漸適應(yīng)高甲醇濃度的環(huán)境。在經(jīng)過80次連續(xù)傳代后，菌株可在7%甲醇環(huán)境中具有較好的生長量。菌株MB200mTB在甲醇培養(yǎng)基中的耐甲醇結(jié)果如圖2所示。

菌株MB200mTB經(jīng)在甲醇培養(yǎng)基中反復(fù)傳代馴化后，其對(duì)甲醇的耐受性有較大的提高。在未經(jīng)甲醇誘導(dǎo)時(shí)，MB200mTB菌體在甲醇濃度1%的培養(yǎng)基中生長速度較為緩慢，在接種48 h后OD600值由0.05升至0.855。而經(jīng)連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，在7%甲醇濃度含量培養(yǎng)基中，菌體生長得到大幅提升，在接種48 h后OD600值由0.05漲至2.583?？梢?，經(jīng)過在不斷升高的甲醇濃度環(huán)境中對(duì)菌體進(jìn)行誘導(dǎo)突變，菌株的甲醇耐受性有極大的提升。

圖2 MB200mTB甲醇誘導(dǎo)前后生長比較

2.4 重組菌株MB200mTB的構(gòu)建

利用引物MutL-F和MutL-R，從克隆載體pMD18T-MutL中擴(kuò)增出mutL目的片段，膠回收后進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切處理的載體pCM80連接，構(gòu)建表達(dá)載體pCM80-mutL(圖3)，化學(xué)轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布到含Tc的X-gal和IPTG的平板上，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，將陽性重組子命名為E.coliDH5α/pCM80-mutL。

圖3 表達(dá)載體pCM80-mutL的構(gòu)建

以篩選到的耐高濃度甲醇菌株MB200mTB為受體菌進(jìn)行三親本接合，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入MB200mTB中，構(gòu)建重組菌MB200mTB/pCM80-mutL。平板培養(yǎng)后稀釋涂布于含Nm 50 μg/mL、Tc 15 μg/mL的固體MM平板上進(jìn)行篩選，32 ℃倒置培養(yǎng)72 h。共得到20株篩選子(Nmr,Tcr)即重組株命名為MB200mHB1-MB200mHB20。

2.5 重組株MB200mHB遺傳性狀穩(wěn)定性

連續(xù)在7%甲醇培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10代，記錄每一代菌液生長狀況，其中有7株菌體生長狀況優(yōu)異，在7%甲醇濃度下具有較好的生長性狀，其余菌株雖在7%甲醇濃度條件下可以生長，但菌體生長速度和菌體量未有較大提升(圖4)。

A：1%甲醇濃度下菌株生長曲線;B：MB200mTB1不同甲醇濃度下生長曲線

在7%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，可以生存的菌株產(chǎn)生了明顯的生長性狀差異。既存在可以利用高濃度甲醇進(jìn)行快速生長繁殖的菌株，也存在可生長緩慢的菌株。在通過三親本結(jié)合進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性恢復(fù)后，MB200mHB1-MB200mHB20均在連續(xù)10代液體培養(yǎng)中OD600值及菌體量接近，生長穩(wěn)定。

2.6 野生菌與重組菌生長情況分析

按0.5%的接種量將活化后的M. sp. MB200和MB200mHB1分別轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的甲醇含量為1%的MM液體培養(yǎng)基中；另將MB200mHB1按0.5%的接種量接入甲醇含量分別為1%和7%的100 mL新鮮的MM液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床32 ℃ 200 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每隔6小時(shí)取樣，使用分光光度計(jì)檢測菌液OD600數(shù)值，最后繪OD600與時(shí)間的曲線圖(圖4)，來衡量菌株的生長情況。

結(jié)果表明，在甲醇濃度較低的培養(yǎng)基中(1%甲醇濃度)，重組菌MB200mHB1生長速度更快，較野生菌M.sp. MB200提前8 h到達(dá)對(duì)數(shù)期，且其在穩(wěn)定期的菌體量更大。在不同的甲醇濃度下，MB200mHB1具有不同的生長速度。當(dāng)培養(yǎng)基甲醇濃度較低(1%甲醇濃度)，菌體快速生長且更早到達(dá)對(duì)數(shù)期，但由于培養(yǎng)基甲醇含量較低，在穩(wěn)定期生長一段時(shí)間后開始出現(xiàn)菌體消融現(xiàn)象。而在7%濃度下，菌體生長量較在1%甲醇濃度下的生長量大，且在達(dá)到生長期后能夠維持較長時(shí)間。

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)建了甲基營養(yǎng)菌M. sp. MB200的mutL基因突變株MB200mTB，在甲醇不斷增高的培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)突變，平板篩選到20株可以在7%甲醇環(huán)境中生長的菌株，三親本結(jié)合進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性恢復(fù)后，獲得20株可穩(wěn)定遺傳的重組菌株。其中有7株重組菌株的生長性狀較野生菌株M. sp. MB200得到極大提升，不僅可以在7%甲醇條件下快速生長繁殖，且其菌體量較野生菌得到極大提升，甲醇耐受性提升近4倍。

甲醇作為甲基營養(yǎng)菌M. sp. MB200可利用的能源與碳源，菌體對(duì)甲醇的耐受能力一定程度上影響菌體的生長，進(jìn)而限制了利用甲基營養(yǎng)菌進(jìn)行各種生物合成的能力。通過對(duì)菌體進(jìn)行連續(xù)的甲醇環(huán)境誘導(dǎo)突變，獲得高甲醇耐受的菌株，可以進(jìn)一步研究甲基營養(yǎng)菌利用甲醇的機(jī)制。同時(shí)可對(duì)高甲醇耐受的菌株進(jìn)行針對(duì)性改造，獲得性狀優(yōu)良的工程菌，為大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)提供可能。