曹永梅

上海旺旺食品集團有限公司,上海 201103

食品安全是全球關注的重大問題。金黃色葡萄球菌[1]、單核細胞增生李斯特氏菌以及沙門氏菌等食源性致病菌的檢出有賴于快速、高效、專一和靈敏的檢測方法[2-6]。筆者應用自主研發(fā)的快檢試劑盒(溶液)檢測食源性致病菌。針對外部第三方客戶(以下簡稱A)使用該快速試劑盒過程中出現(xiàn)的問題，經(jīng)采用留存的同批次試劑盒和同批次樣本進行了重復測試，得出了個別樣本和對照組出現(xiàn)的假陽性和假陰性問題的可能原因以及相應采取的對策，從而為改進檢測技術及試劑盒生產(chǎn)制備工藝優(yōu)化提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特氏菌快檢試劑盒(本實驗室自主研發(fā)[7,8])。

菌種金黃色葡萄球菌CICC21600和單增李斯特菌CICC21635由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種活化

1.2.1.1菌懸液制備

A根據(jù)菌種活化說明書，往菌粉中分別加入1支腦浸液，制成菌懸液，備用。本實驗將菌種在37 ℃水浴中快速解凍，取一環(huán)菌液劃線接種平板，培養(yǎng)過夜。取已滅菌的含30%甘油營養(yǎng)肉湯10 mL于15 mL 離心管中，刮取平板上的細菌于離心管中，混勻分裝，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2接種

每種菌4個平板，每個平板接種200 μL，金黃色葡萄球菌于36 ℃、李斯特菌于30 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，選取單個生長良好的菌落，備用。

1.2.2人工污染樣本制備

1.2.2.1培養(yǎng)基制備

液體培養(yǎng)基配制量如表1, 121 ℃ 15 min滅菌后備用。制備金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板和血平板、李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板，冷藏備用。

表1 不同致病菌培養(yǎng)基種類及培養(yǎng)條件

1.2.2.2污染樣本基質

人工染菌基質是果凍、QQ糖、牛奶和小饅頭等四種食品, 每種所需的樣本量為5 g, 接種量見表2。

(1) 空白組不接種菌：直接將配制好的液體培養(yǎng)基分裝成4份，每份50 mL，依次加入裝有試驗樣本的均質袋中，拍擊混勻。

表2 不同菌的接種數(shù)

(2) 接種低濃度菌、高濃度菌：按表2將菌落分別接種到對應培養(yǎng)基中，攪拌混勻后分裝，其余同(1)。

(3) 按表1的培養(yǎng)溫度分別培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.3檢測

國標法，其中金黃色葡萄球菌按GB4789.10-2016[9]，單核細胞增生李斯特氏菌按GB4789.30-2016[10]操作?？鞕z法[7,8]按照試劑盒說明書分別進行核酸提取和擴增檢測。陰性對照處理(kit-)呈橙色，為陰性結果，陽性對照處理(Kit+)呈熒光綠色，為陽性結果。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌測試結果

2.1.1金黃色葡萄球菌國標法

A實驗中所有陰性樣本均未檢出，陽性樣本全部檢出。本實驗陽性樣本全部檢出，但果凍I陰性對照樣本平板上長菌，其他正常，如表4國標法。

2.1.2金黃色葡萄球菌快檢法

A實驗的陰性樣本均未檢出，但發(fā)現(xiàn)陽性樣本只有QQ糖基質檢出，果凍I和牛奶基質均未檢出，重復試驗發(fā)現(xiàn)仍然只有QQ糖陽性樣本檢出，另兩種陽性樣本均未檢出(見表3)。

表3 A快檢法結果

本實驗采用快檢法的結果如表4快檢法和圖2所示，4種基質的人工染菌陽性樣本均被檢出，QQ糖、牛奶和小饅頭基質的陰性樣本均未檢出，然而果凍I陰性樣本(即未人工污染樣本)也被檢出，與上述國標法檢測結果一致。

表4 金黃色葡萄球菌測試結果

2.1.3第二次重復測試

針對上述測試中，果凍I陰性對照樣本采用國標法和快檢法同時出現(xiàn)陽性結果的問題，本實驗對果凍I和II兩個批次果凍樣本進行了重復測試。第二次國標法和快檢法結果顯示，果凍I和II的陰性樣本均未檢出，陽性樣本均被檢出，如表5、圖3和圖4。

圖1 金黃色葡萄球菌國標法結果

圖2 金黃色葡萄球菌快檢法結果

表5 金黃色葡萄球菌果凍基質樣本重復測試結果

圖3 金黃色葡萄球菌果凍基質樣本重復測試國標法結果

圖4 金黃色葡萄球菌果凍基質樣本重復測試快檢法結果

2.2 單核細胞增生李斯特氏菌測試結果

2.2.1單增李斯特菌國標法

實驗結果如表6和圖5，4種基質所有陽性樣本均被檢出，PALCAM平板上呈小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷[8]；李斯特顯色平板上有藍綠色菌落，菌落周圍有一不透明環(huán)。未接種陰性對照平板上不長菌，所有陰性樣本均未檢出。

表6 單核細胞增生李斯特氏菌測試結果

2.2.2單增李斯特菌快檢法

A實驗中果凍I基質的陰性樣本和陽性樣本均被檢出，但經(jīng)實驗重復驗證，結果顯示4種基質所有陰性樣本均未檢出(圖6)，與上述國標法結果一致。

圖5 單核細胞增生李斯特氏菌國標法結果

圖6 單核細胞增生李斯特氏菌快檢法結果

3 討論與結論

3.1 金黃色葡萄球菌試劑盒測試果凍和牛奶陽性樣本中出現(xiàn)假陰性的原因分析

此前本實驗室在牛奶和果凍兩種食品基質中均曾測試成功，檢出靈敏度為1 CFU/25 g。本實驗采用國標法和快檢法對同批次試劑盒和同批次食品樣本的重復測試實驗中，4種基質陽性樣本均被檢出。

綜上，假陰性問題可能是試劑在運輸、儲存以及實驗過程中操作不當造成活性降低所引起。針對試劑的運輸和儲存環(huán)節(jié)，本實驗室正在開展干粉化工藝優(yōu)化。針對實驗操作中可能出現(xiàn)的問題，可以通過對試劑進行小管分裝、干粉化等方式防止試劑活性降低。

需要注意的是，果凍I陰性樣本在本實驗第一次測試中，國標法和快檢法均呈陽性，但第二次重復驗證兩批陰性樣本均未檢出。分析原因，可能是操作過程中引入了金黃色葡萄球菌，或者樣本中污染有分布不均的金黃色葡萄球菌(發(fā)生假陽性結果的樣本批次早于用于重復測試的樣本II)，可排除試劑盒本身的質量問題。結果提示，檢測反應體系的污染控制是非常關鍵的環(huán)節(jié)。另外，當檢測到假陽性結果后，應重復實驗，通過采用不同批次樣本、不同批次試劑的方式控制實驗過程，確認檢測結果。

3.2 單增李斯特菌試劑盒對果凍基質陰性樣本測試時出現(xiàn)假陽性的原因分析

分析推測，假陽性可能是由于實驗室空間內的氣溶膠污染所造成的。

作為一種快檢方法，本方法靈敏度高，優(yōu)點是可快速篩選出高危樣本，盡可能避免陽性樣本被漏檢(假陰性)；與之對應的缺點是，一旦實驗室操作空間內有微量的待測菌或者DNA，相比國標培養(yǎng)法，更容易造成假陽性。這是所有PCR類核酸擴增方法普遍存在的問題。同理，當實驗環(huán)境中高靈敏度方法與低靈敏度方法共存，更容易造成假陽性問題。因此，出現(xiàn)陽性時，通過國標法進一步驗證。

既要保留核酸擴增反應的快速、高靈敏度特性，又要規(guī)避污染問題，是目前本領域的挑戰(zhàn)之一。目前本實驗室正就試劑盒生產(chǎn)工藝做改進，通過避免開蓋、減少操作步驟等方式防范和減少污染，降低假陽性。

3.3 淀粉樣本出現(xiàn)的預處理問題

小饅頭基質在沉淀加入核酸抽提試劑，100 ℃ 15 min，碎冰或冰盒中靜置10 min后會凝結成塊，離心無法得到上清液。這是由于小饅頭中含有大量淀粉，吸水性強，增菌液混入該介質后很容易凝結成塊，發(fā)生上清液難以析出的問題。

本實驗采用先將增菌液搖勻，略等基質沉淀后再取增菌液，在兩種快檢試劑盒上都取得預期的檢測結果，即陰性樣本均未檢出，陽性樣本均被檢出。

因此，為避免類似基質造成困擾，可以在說明書中增加相關描述，如“略等食品介質沉淀后再取增菌液”。此外，還可以使用帶濾膜的均質袋進行增菌，或者多加一步增菌步驟。

在研發(fā)過程中，不同食品由于大分子含量、pH、鹽濃度等因素對于反應體系的各個環(huán)節(jié)會有不同程度的影響，如何讓檢測體系適應不同類型的檢測對象，也是本實驗目前研發(fā)工作的一個關注點。

3.4 檢出限(靈敏度)

需要特別指出的是，在對樣本進行人工染菌的操作環(huán)節(jié)，A測試與本實驗室此前的操作有所不同。外部實驗是從培養(yǎng)基平板上挑取經(jīng)過純培養(yǎng)的若干個單菌落接種樣本；本實驗室的方法是先將病原菌液體培養(yǎng)、計數(shù)、稀釋，然后分別將16、8、4、2、1和0.5 CFU/mL細菌接種到擬檢測的樣本中。從方法設計上可以看出，自主研發(fā)的技術體系靈敏度更高。

為了與外部測試結果進行嚴格的比對，本次驗證實驗在人工染菌等環(huán)節(jié)，采用了與之相同的實驗方法。

本文查明試劑盒初步測試結果出現(xiàn)假陰性和假陽性的原因，為下一步檢測技術及試劑盒生產(chǎn)制備工藝的優(yōu)化提供有益的參考。