彭 紅， 周 剛， 王穎思， 謝小保， 施慶珊

廣東省微生物研究所，廣東省科學(xué)院，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室， 廣州 510070

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)統(tǒng)計，全球每年有數(shù)百萬人因使用化學(xué)殺菌劑而引起中毒等諸多健康威脅，化學(xué)殺菌劑長期大量以及不正當(dāng)使用使得很多微生物對其產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[1]。這促使科研人員從現(xiàn)有的具優(yōu)異殺菌功能的天然植物中挖掘更多的活性成分，特別是從黃花蒿中提取到有效抑制瘧疾的青蒿素的屠呦呦教授獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，以及在新型冠狀病毒防治過程中，中草藥制劑和療法多次出現(xiàn)在診療方案中，這些必定會將我國的天然產(chǎn)物抑菌抗病毒研究和開發(fā)利用推向新的高潮。

科研人員已發(fā)現(xiàn)全世界約1600種以上的植物含有殺菌、殺蟲、抗病毒活性物質(zhì)，其中研究較多的是楝科植物，主要包括苦楝、川楝和印楝。早期以苦楝樹的枝葉及果實為原材料制作的肥皂，有殺菌消炎作用，農(nóng)村曾有用苦楝治療小孩蟯蟲的案例，即便現(xiàn)今，苦楝仍是天然便利的殺蟲殺菌首選之物，淡水魚養(yǎng)殖業(yè)習(xí)慣向養(yǎng)殖水域投放苦楝果防治魚病，醫(yī)藥行業(yè)用苦楝果治療各種真菌感染皮膚病(如癬、疥瘡等)，并且，人體外用的中藥配方中常用到苦楝果或苦楝皮。

本文通過苦楝果水提物對幾種代表G-的大腸桿菌、銅綠假單胞菌，G+的金黃色葡萄球菌，芽胞菌的枯草芽胞桿菌，酵母菌的白色念珠菌，以及真菌的黑曲霉進(jìn)行抑菌效果研究，充分揭示苦楝果的抑菌活性功效，為苦楝作為更廣泛的抗菌藥物開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:大腸桿菌(EscherichiacoliATCC25922)、金黃色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusATCC9372)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC10231)、黑曲霉(AspergillusnigerATCC16404)由廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室提供。

試劑和培養(yǎng)基: PDA馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基、NA營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

儀器: 烘箱(廣東環(huán)凱 DHG-9240A型)、粉碎機(長沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司 QXQM-0.4)、超聲儀(上海安譜實驗科技股份有限公司 2102T型)、氣液兩用隔膜真空泵(廣東環(huán)凱 SZKB-3B)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司 N-1100)、高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司 H1850R)、恒溫培養(yǎng)箱(廣東環(huán)凱 DNP-9082)、潔凈工作臺(廣東環(huán)凱 HK-C2)、高壓滅菌鍋(ZEALWAY G154 TR)、電子精密天平(SHIMADZU AUY220)。

1.2 苦楝果水提物制備

將購買的苦楝果(廣州同仁堂藥店，批號：20200108)用純水清洗(以除去表面塵土)，瀝干水分放入烘箱，65 ℃烘箱烘干至恒重，再對樣品作粉碎處理，粉碎至顆粒直徑≤1 mm，得到苦楝果粉，密封袋保存?zhèn)溆?。稱取100 g苦楝果粉置于1 000 mL蒸餾水中，室溫下超聲作用30 min，然后加熱煮沸30 min，再次置于超聲儀中作用30 min，用200目紗布過濾得到提取液，將濾渣加入到500 mL蒸餾水中煮沸30 min，用200目紗布過濾得到提取液，合并兩次提取液，高速離心分離(10 000 r/min)10min，取上清液。用400目尼龍濾布減壓抽濾，再用0.45 μm濾膜減壓抽濾。并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上保持真空度-0.1～-0.08 MPa，減壓濃縮至100 mL，最終得濃縮液的濃度約為1.0 g/mL。經(jīng)121℃滅菌20 min后，得到苦楝果提取物濃縮液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｒ哉麴s水稀釋上述苦楝果提取物至0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL。

1.3 懸液定量抑菌法測定苦楝果水提物的抑菌活性

分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌單個典型菌落接種NA(普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)斜面，培養(yǎng)后用PBS洗下并稀釋配制成含菌量為5×107～5×108CFU /mL菌懸液，白色念珠菌、黑曲霉接種于PDA(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基)斜面，培養(yǎng)后用PBS洗下并稀釋配制成含菌量為5×105～5×106CFU /mL菌懸液，備用。

分別取各濃度的苦楝果提取物及其稀釋液1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL，同時以無菌蒸餾水作為空白對照，量取各藥液及空白對照9 mL于各無菌試管內(nèi)，置 20 ℃±1℃水浴中 5 min 后，分別加入1 mL菌懸液，輕輕搖動混勻，于37℃條件培養(yǎng)，黑曲霉于30℃條件培養(yǎng)，作用至預(yù)定時間10 min、30 min、1 h、3 h、5 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h分別對各試管內(nèi)加菌藥液進(jìn)行活菌計數(shù)，與相應(yīng)時間段的各空白對照中該菌的菌量進(jìn)行對比，每個樣品做3個平行，取平均值并使用按照下面的公式計算其抑菌率。

2 結(jié)果

2.1 苦楝果水提物對革蘭氏陰性菌的抑菌效果

為了評價苦楝果水提物對革蘭氏陰性菌的抑菌效果，選取大腸桿菌和銅綠假單胞菌作為試驗對象，分別測定了不同濃度的苦楝果水提物對上述兩種菌株在10 min、30 min、1 h、3 h、5 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h各時間的抑菌率，其試驗結(jié)果見表1。

如表1所示，1.0 g/mL、0.5 g/mL和0.33 g/mL苦楝果水提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌作用時間在5 h就達(dá)到最高抑菌率> 99.99%，之后一直保持> 99.99%的抑菌效果；0.25 g/mL苦楝果水提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌作用時間在12 h達(dá)到最高抑菌率> 99.99%，之后一直保持> 99.99%的抑菌效果。

表1 不同濃度的苦楝果水提物在不同時間對革蘭氏陰性菌的抑菌率(%)

2.2 苦楝果水提物對革蘭氏陽性菌的抑菌效果

苦楝果水提物對革蘭氏陰性菌具有較好的抑菌作用，為了進(jìn)一步評價苦楝果水提物對革蘭氏陽性菌的抑菌效果，選取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為試驗對象，分別測定了不同濃度的苦楝果水提物對上述兩個菌株在不同時間點的抑菌率，其試驗結(jié)果見表2。

表2 不同濃度的苦楝果水提物在不同時間對革蘭氏陽性菌的抑菌率(%)

如表2所示，1.0 g/mL苦楝果水提物對金黃色葡萄球菌的作用時間在5 h就達(dá)到最高抑菌率>99.99%，之后一直保持> 99.99%的抑菌效果。0.5 g/mL、0.33 g/mL、0.25 g/mL苦楝果水提物對金黃色葡萄球菌作用時間在12 h就達(dá)到最高抑菌率：99.97%、99.74%和85.12%，之后抑菌率隨時間遞增而下降，0.25 g/mL在作用至48 h抑菌率降至0。1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25g/mL苦楝果水提物對枯草芽孢桿菌作用時間在12 h達(dá)到最高抑菌率：99.33%、95.25%、75.26%和65.25%，之后抑菌率隨時間遞增而下降，0.33 g/mL在作用至72 h抑菌率降至0，0.25 g/mL在作用至48 h抑菌率降至0。

2.3 苦楝果水提物對真菌的抑菌效果

苦楝果水提物對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有較好的抑制作用，為了進(jìn)一步評價苦楝果水提物對真菌的抑菌效果，選取白色念珠菌和黑曲霉作為試驗對象，分別測定了不同濃度的苦楝果水提物對上述兩個真菌菌株在不同時間點的抑菌率，其試驗結(jié)果見表3。

如表3所示，1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL苦楝果水提物對白色念珠菌作用時間在12 h達(dá)到最高抑菌率：90.68%、70.35%、65.25%和60.50%，之后抑菌率隨時間遞增而下降，0.5 g/mL在作用至96 h抑菌率降至0，0.33 g/mL在作用至72 h抑菌率降至0，0.25 g/mL在作用至48h抑菌率降至0。與此同時，1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL苦楝果水提物對黑曲霉作用時間在12h達(dá)到最高抑菌率：92.65%、89.25%、78.20%和58.25%，之后抑菌率隨時間遞增而下降，0.33 g/mL在作用至120 h抑菌率降至0，0.25 g/mL在作用至48 h抑菌率降至0。

表3 不同濃度的苦楝果水提物在不同時間對酵母和真菌的抑菌率(%)

3 討論

國內(nèi)外多位學(xué)者研究了苦楝的殺菌抗菌生物活性。魏琴等[2]從苦楝仁的提取物對小麥赤霉病原菌(Graminearumsehw)、辣椒疫霉病原菌(Phytophthoracapsici)、蘋果炭疽病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)三種真菌菌絲和孢子的生長有一定的抑制活性，對變形桿菌(Proteusvulgaris)有較強的抑制作用。張峰等[3]用苦楝葉揮發(fā)油25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL 和 100 mg/mL分別處理大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉，均有較強的抑制效果，其抑制強弱順序為：黑曲霉 > 大腸桿菌 > 金黃色葡萄球菌。而本研究中苦楝果水提物對幾種菌的抑菌效果依次為：大腸桿菌 > 銅綠假單胞菌 > 金黃色葡萄球菌 > 白色念珠菌 > 枯草芽孢桿菌 > 黑曲霉，不同的研究發(fā)現(xiàn)微生物對苦楝提取物的敏感順序不一樣，一方面是由于使用了不同的苦楝部位，如葉子、果實、樹根等，不同部位的提取物具有不同的活性成分；另一方面是因為不同的研究使用了不同的提取方法，而已經(jīng)有研究證明用不同的提取方法對相同的部位進(jìn)行提取，會提取到不同的活性成分，或者活性成分的比例也有差別；本研究中使用苦楝的果實進(jìn)行超聲加水提，最大限度的避免了提取液對抑菌效能的影響。

馬玉翔[4]用苦楝果仁甲醇提取的有效成分，以瓊脂稀釋法測得對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為 30 mg/mL、7.5 mg/mL、7.5 mg/mL，最小殺菌濃度(MBC)分別為 30 mg/mL、15 mg/mL和15 mg/mL。翟興禮等[5]將不同濃度的苦楝果實提取液，測定其對巨大芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)抑菌作用隨提取液濃度增加而增強，對枯草芽孢桿菌的抑菌活性最大。彭紅[6]等發(fā)現(xiàn)從苦楝中提取的苦楝素對白色念珠菌浮游菌生長及其生物膜的形成具有較好的抑制效果，同時苦楝素與BIT對白色念珠菌具有協(xié)同抑菌作用。SANNA[7]對苦楝果甲醇提取物和4種苦楝果類檸檬苦素的細(xì)胞毒性、抗病毒和抗分枝桿菌活性。對苦楝果甲醇提取物 3-α-紫杉醇和庫拉酸甲酯顯示出良好的抗分枝桿菌活性(MIC值分別為 29 μmol/L 和 70 μmol/L)。PIGNATA[8]研究了苦楝樹的化學(xué)參數(shù)與城市環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)苦楝樹對交通及工業(yè)造成的空氣污染非常敏感。胡仁火[9]等在研究廣玉蘭、紅葉石楠、木豆、迎春花、苦楝和紅葉李等 6 種校園綠化植物滯塵、抑菌和殺菌的研究中，發(fā)現(xiàn)苦楝的抑菌效果最優(yōu)，抑菌率為 88.9%。楊小鳳等[10]用苦楝醇浸劑(1∶4)能抑制 7 種癬菌(許蘭氏黃蘚菌、黃色毛癬菌、紅色皮膚癬菌、鐵銹色小芽孢癬菌、奧杜盎氏小芽孢癬菌、羊毛狀小芽孢癬菌、同心性毛癬菌)和星形奴卡氏肺炎菌的生長。姜萍等[11]研究了苦楝樹皮乙醇提取物對綠色木霉和黑曲霉有很好的抑菌活性。CHINNASAMY[12]利用苦楝葉提取物生物合成銀納米顆粒(MA-AgNPs)，具有增強抗菌、傷口愈合、抗糖尿病和抗氧化活性。ABBAS[13]以苦楝花在不同溶劑中對3種真菌(黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉)進(jìn)行抑菌實驗，苦楝花甲醇提取物對黃曲霉的抑菌活性最強，抑菌圈為(19.6±0.66) mm。二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇提取物的抑菌活性分別為(18±0.57) mm、(18.6±0.88) mm 和(18±0.66) mm。正丁醇提取物對黑曲霉的抑菌活性較低，抑制區(qū)為(13.6±0.88) mm。二氯甲烷和甲醇提取物對黃曲霉的最低抑菌濃度為(13.909±1.5) μg/mL。認(rèn)為苦楝花提取物具有良好的抗真菌活性。從以上文獻(xiàn)比較，從苦楝中提取有效成分常采用有機溶劑如乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取，但是有機溶劑提取的苦楝有效物質(zhì)，水溶性差，抑菌實驗中需再次經(jīng)有機溶劑(如乙醇)溶解才能進(jìn)行，當(dāng)樣品遇水，苦楝有效物析出，并且乙醇本身對目標(biāo)菌株的生長有抑制作用，這都嚴(yán)重影響抑菌實驗效果評價。本文以傳統(tǒng)“水提”加“超聲”輔助的簡化提取工藝，充分快速提取苦楝果的有效成分，以懸液定量抑菌法測定苦楝果水提物的抑菌活性，保證了抑菌實驗免受乙醇等萃取劑的外因干擾，真實反映了苦楝提取物優(yōu)異的抑菌活性。

綜上所述，苦楝不同部位的提取物對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌，都具有很好的抑制甚至殺滅作用，但是由于使用的苦楝部位和提取方法的差異，導(dǎo)致不同的抑菌和殺菌活性，但我們使用的苦楝果超聲加水提的簡便方法依然可以提取到抑菌活性成分，并且在很低的濃度(1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL)就具有較好的抑菌活性，該提取方法可以推廣到苦楝樹葉和樹皮等抑菌活性成分的提取，本研究結(jié)果真實反映了苦楝水提物對幾種微生物優(yōu)異的抑菌活性，但其對目標(biāo)菌株的作用機理，真正起抑菌作用的活性成分等，有待進(jìn)一步的深入研究和解析，從而發(fā)現(xiàn)新的抑菌活性分子和明確抑菌作用機制，為開發(fā)新的抑菌藥物積累物質(zhì)基礎(chǔ)和骨架結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

(1) 苦楝果水提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的生長都具有較好的抑制作用。

(2) 苦楝果水提物對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌效果最好，對芽胞桿菌和酵母、真菌的抑菌效果相對較差，抑菌效果強弱依次為：大腸桿菌>銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌>白色念珠菌>枯草芽孢桿菌>黑曲霉。

(3) 苦楝果提取物對幾種微生物的抑菌具有濃度依賴性，濃度越高，抑菌效果越好，1.0 g/mL水提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌作用時間在5 h抑菌率大于99.99%，之后一直保持了極強的抑菌作用。0.5 g/mL水提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌作用時間在5 h抑菌率大于99.99%，之后一直保持了極強的抑菌作用，對枯草芽孢桿菌作用時間在12 h抑菌率達(dá)到最高99.97%，之后抑菌率隨時間遞增而下降。而低濃度的0.25 g/mL水提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌作用時間在12 h抑菌率才大于99.99%。

(4) 苦楝果水提物抑菌效果與作用時間相關(guān)，極強抑菌效果的試驗組在5 h就達(dá)到最好，之后一直保持極強的抑菌效果，而抑菌效果不是極強的試驗組在作用到12 h達(dá)到最好抑菌效果，之后隨時間遞增而抑菌效果降低。