謝朋飛，崔宏娣，陳元璐，龍輝，金玉，任軍，李雪芳，楊鵬，周燕，張永東

(1.郴州市第一人民醫(yī)院Ⅰ期臨床研究室，湖南 郴州 423000； 2.上海海虹實業(yè)(集團)巢湖今辰藥業(yè)有限公司，安徽 巢湖 238000； 3.安徽萬邦醫(yī)藥科技股份有限公司，安徽 合肥 230601)

曲格列汀(Trelagliptin，TRE)是由日本武田藥品工業(yè)株式會社和Furiex公司共同開發(fā)的全球首個長效二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制劑，通過選擇性、持續(xù)性抑制DPP-4而控制血糖水平[1-3]。曲格列汀具有良好的安全性和耐受性，每周給藥1次便可有效控制血糖水平，患者用藥依從性好，市場前景廣闊[4-5]。

目前，文獻報道曲格列汀檢測方法有HPLC法、LC-MS/MS法[6-10]，但對于生物樣品中曲格列汀的檢測方法報道較少。本研究旨在建立一種具有高靈敏度和高選擇性的HPLC-MS/MS法測定人血漿中曲格列汀的濃度，計算空腹和餐后給藥條件下琥珀酸曲格列汀的藥動學特征，初步評價受試制劑和參比制劑(商品名：Zafatekl?)的生物等效性，為正式試驗和處方工藝篩選優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

受試制劑(T)：琥珀酸曲格列汀片(巢湖今辰藥業(yè)有限公司，規(guī)格：100 mg/片，批號：171205)；參比制劑(R)：琥珀酸曲格列汀片(商品名：Zafatekl?，日本武田藥品工業(yè)株式會社，規(guī)格：100 mg/片，批號：17N0010)；琥珀酸曲格列汀對照品(濟南瑞豐醫(yī)藥科技有限公司，質量分數(shù)99.6%，批號：161114)；內標(卡馬西平Carbamazepine，CAR，質量分數(shù)99.7%，批號：100142-201105，中國食品藥品檢定研究院)；甲醇、乙腈、異丙醇、甲酸(Sigma公司)；屈臣氏飲用水。

1.2 儀器

島津LC-30A液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；AB QTRAP 5500質譜儀(ESI離子源，美國AB公司)；Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件；XP6百萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.3 試驗對象

經(jīng)郴州市第一人民醫(yī)院藥物臨床試驗倫理委員會批準，所有受試者均在簽署書面知情同意書后進入試驗?？崭乖囼炄脒x8例受試者，其中男性3例，女性5例，年齡21～46 a，體重指數(shù)19.9～26.0 kg/m2；餐后試驗入選8例受試者，其中男性5例，女性3例，年齡20～40 a，體重指數(shù)20.5～25.1 kg/m2。

入選標準：年齡18～65 a，男女均可，健康情況良好；體重指數(shù)19.0～26.0 kg/m2，男性受試者體重≥50.0 kg，女性受試者體重≥45.0 kg。試驗前簽署知情同意書、并對試驗內容、過程及可能出現(xiàn)的不良反應充分了解；且能夠按照試驗方案要求完成研究。

排除標準：生命體征、體格檢查及血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、輸血四項、妊娠檢查(女性)、12導聯(lián)心電圖、腹部B超(肝、膽、脾、腎)、藥物濫用篩查、酒精呼氣等檢查異常且具有臨床意義者；有心、肝、腎、內分泌、消化道、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等嚴重疾病史或現(xiàn)有上述系統(tǒng)疾病者。

1.4 研究設計

1.4.1 總體設計 單中心、空腹/餐后、隨機、開放、單劑量、兩序列兩周期雙交叉設計，空腹8例，餐后8例，清洗期18 d。受試人群：普通人群，男女均有，性別比例適當。隨機分組方法：受試者按篩選號順序1∶1比例隨機分配到2個給藥順序組(T-R組/R-T組)之一。給藥劑量：100 mg。給藥方法：空腹或者高脂餐后30 min口服，240 mL溫水送服。服藥前禁食至少10 h，服藥前1 h及服藥后1 h內禁止飲水，服藥后4 h內禁食，服藥后4、10 h統(tǒng)一進食標準午餐和晚餐。

1.4.2 樣本采集與檢測 空腹及餐后采血時間點：給藥前0 h(服藥前1 h內)和給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120.0、144.0、168.0 h；每次采血約4 mL置于EDTA-K2抗凝劑真空負壓管中，輕柔顛倒混勻4～8次，采集后即刻置于冰浴中，于1 h內在2～8 ℃離心10 min(離心力：2 500 g)，分離出血漿，2 h內放置超低溫冰箱(-70±10)℃凍存，直至樣本轉運。轉運過程全程冷鏈監(jiān)控(約-80 ℃)。采用HPLC-MS/MS法測定受試者口服受試制劑或參比制劑后血漿中曲格列汀的血藥濃度。

1.4.3 血漿樣本處理與測定條件

1.4.3.1 色譜條件 色譜柱為Welth Ultimate XB-C18(5 μm，2.1 mm×100 mm)；0.1%甲酸為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫(0～0.5 min，95%A；1.2 min，35%A；2.8 min，5%A；3 min，95%A)；流速：0.5 mL/min，梯度洗脫；柱溫30.0 ℃，進樣器溫度為4 ℃，進樣量5 μL。

1.4.3.2 質譜條件 質譜條件采用正離子電噴霧離子化(ESI)電離模式，多反應監(jiān)測模式(MRM)掃描模式。曲格列汀離子對m/z358.2→134.0，內標卡馬西平離子對m/z237.1→194.0。離子源參數(shù)設置：噴霧電壓為5.5 kV，氣簾氣241.33 kPa，霧化氣為344.75 kPa，輔助加熱氣為379.23 kPa，離子源溫度550 ℃，入口電壓為10 V。

1.4.3.3 標準曲線、質控血漿樣品制備 精密稱取適量的曲格列汀對照品，用甲醇溶液配制曲格列汀儲備液并稀釋制得標準曲線系列工作液，同法配制質控(QC)儲備液及工作液。精密稱取適量的卡馬西平對照品，用甲醇溶液配制卡馬西平儲備液并稀釋成10 ng/mL內標工作溶液。臨用前以標準曲線工作液10 μL加入空白血漿190 μL的比例混勻即得標準曲線血漿樣品。標準曲線血漿樣品STD1～STD8(含曲格列汀1、2、5、20、80、320、640、800 ng/mL)。各質控點濃度值為：LLOQ(1 ng/mL)、LQC(3 ng/mL)、M1QC(25 ng/mL)、M2QC(200 ng/mL)、HQC(600 ng/mL)。每批隨行標準曲線均合格(各濃度點的回算濃度與理論濃度的偏差在±15%范圍內，定量下限的偏差在±20%范圍內；包含至少6個符合接受標準的非零濃度點；回歸方程的線性相關系數(shù)r>0.99)。

1.4.3.4 血漿樣品處理 在96孔板中加入50 μL樣品；雙空白樣品，加入體積分數(shù)50%甲醇50 μL，其他樣品加入內標工作液50 μL，渦旋混勻；每一個樣品孔中加入乙腈200 μL，封板，混勻5 min；樣品在4 ℃、4 200 r/min離心10 min；離心后轉移100 μL上清液至另一96孔板中，加入200 μL純水，封板，混勻5 min；樣品在4 ℃、 4 200 r/min離心10 min，取上清液進樣。

1.5 方法學考察與評價

1.5.1 專屬性考察 取6份不同批次未混合的健康受試者空白EDTA-K2血漿，分別進行不加內標的空白樣品測定和在LLOQ水平的添加試驗。結果顯示，空白人血漿樣本在待測物出峰處的峰面積不超過定量下限待測物峰面積的20.0%，內標物出峰處的峰面積不超過定量下限樣品的內標物峰面積的5.0%，表明方法專屬性良好，血漿中內源性物質不干擾待測物和內標的測定，見圖1。

A.空白基質； B.定量下限LLOQ樣品(曲格列?。? ng/mL)和內標卡馬西平； C.標準曲線工作液STD05樣品(曲格列汀：80 ng/mL)和內標卡馬西平； 曲格列汀(tR=1.72 min)； 卡馬西平(tR=2.07 min)。

1.5.2 標準曲線與定量下限 配制標準曲線血漿樣品STD1～STD8(含曲格列汀1、2、5、20、80、320、640、800 ng/mL)，按“血漿樣本處理”項下操作后進樣分析，建立曲格列汀的標準曲線。以待測物曲格列汀濃度(X,ng/mL)為橫坐標，待測物色譜峰面積(As)與內標色譜峰面積(Ai)的比值(Y=As/Ai)為縱坐標，用加權(1/X2)最小二乘法進行線性回歸運算。結果顯示，曲格列汀在1～800 ng/mL內線性關系良好，標準曲線為Y=3.32×10-3X+2.21×10-4(R2= 0.992)，最低定量下限為1 ng/mL(LLOQ)。

1.5.3 精密度與回收率試驗 量取曲格列汀LLOQ、LQC、M1QC、M2QC和HQC 5個質量濃度的質控樣品考察批內及批間精密度與準確度。每一濃度6份，連續(xù)測定3個批次。按“血漿樣本處理”項下操作后進樣分析，以測得濃度計算日內及日間精密度。用低(LQC)、中(M2QC)、高(HQC)3個質量濃度水平的樣本計算人血漿提取樣本加內標的峰面積比值，與空白人血漿經(jīng)提取后的樣本再加入代謝物和內標后測得的峰面積比值進行比較，計算回收率。結果5個質量濃度水平的質控樣品檢測結果的批內和批間精密度均小于15.0%，回收率在92.9%～97.6%之間，見表1。

表1 曲格列汀在人血漿中的精密度和回收率Table 1 Precision and recovery of trelagliptin in human plasma

1.5.4 基質效應 用6份不同來源的空白基質考察內標工作濃度下和待測物低、中、高(3、200、600 ng/mL)3個質量濃度水平下的基質效應。3個質量濃度水平內標歸一化的基質因子值為98.8%～101.8%，精密度≤5.3%，符合要求。分別用模擬的溶血血漿(在正常的空白血漿中加入一定量溶血的全血得到2%溶血水平的溶血血漿)及高脂血漿[在正?？瞻籽獫{加入脂肪乳注射液(3 mg/mL，以甘油三酯含量計算)制備低濃度(LQC 3 ng/mL)和高濃度(HQC 600 ng/mL)]的質控樣品，每個濃度平行處理6份樣品。溶血基質中LQC、HQC基質效應的CV值分別為7.1%、0.8%；高脂基質中LQC、HQC基質效應的CV值分別為5.9%、3.9%，均≤15%，表明溶血基質及高脂血基質均不影響血漿中曲格列汀的準確定量，符合生物樣品分析要求。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗 配制含曲格列汀的低、高質量濃度(3、600 ng/mL)的全血和血漿質控樣本，分別考察全血質控樣本室溫放置2 h、血漿質控樣本室溫下立即處理、室溫放置29 h、-20 ℃/-70 ℃反復凍融5次、-20 ℃/-70 ℃長期存放(至少涵蓋從第1個樣品采集至樣品分析結束的時間段)、樣本處理后置于室溫條件下5 h、自動進樣器中或與自動進樣器相同溫度的環(huán)境77 h后的穩(wěn)定性。結果表明，低、高質量濃度全血和血漿質控樣本在上述條件下均穩(wěn)定性良好。

1.6 藥動學參數(shù)計算及生物等效性判定

使用非房室模型(NCA)方法，用WinNonlin 7.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算藥動學參數(shù)，對主要藥動學參數(shù)(Cmax、AUC0-t、AUC0-∞)進行自然對數(shù)轉換后，考慮周期效應、制劑效應、序列效應、受試者(隨序列)效應和殘差，以lnCmax、lnAUC0-t、lnAUC0-∞為因變量進行多因素方差分析，對Tmax進行非參數(shù)檢驗(Wilcoxon符號秩檢驗)。以方差分析結果為基礎，采用90%CI分析法，當受試制劑與參比制劑藥動學參數(shù)AUC0-t、AUC0-∞和Cmax的幾何均值比的90%CI均在80.00%～125.00%等效區(qū)間內，則認為兩制劑生物等效。通過觀察生命體征、實驗室檢測及心電圖等不良事件進行安全性評價。

2 結果

2.1 平均血藥濃度-時間曲線

空腹試驗8例受試者、餐后試驗8例受試者完成2周期琥珀酸曲格列汀片(100 mg)受試制劑和參比制劑給藥，按方案要求在規(guī)定時間內完成血樣采集，并進行血藥濃度檢測。平均血藥濃度-時間曲線見圖2、圖3。

圖2 空腹組受試者單次口服琥珀酸曲格列汀片受試制劑(T)和參比制劑(R)后平均血藥濃度-時間曲線Figure 2 Mean plasma concentration-time curve of TRE after taking the test and reference drugs in fasting state (n=8)

圖3 餐后組受試者單次口服琥珀酸曲格列汀片受試制劑(T)和參比制劑(R)后平均血藥濃度-時間曲線Figure 3 Mean plasma concentration-time curve of TRE after taking the test and reference drugs in fed state (n=8)

2.2 藥動學參數(shù)

本臨床試驗過程控制良好，兩周期間基本保持一致，入組受試者均完成試驗，無脫落，未發(fā)生嚴重不良事件。空腹試驗組8例受試者和餐后試驗組8例受試者均納入藥動學參數(shù)集(PKPS)分析，健康受試者空腹和餐后單次口服受試藥物和參比藥物后血漿中琥珀酸曲格列汀片的藥動學參數(shù)見表2。

表2 空腹組和餐后組受試者單次口服琥珀酸曲格列汀片受試制劑(T)和參比制劑(R)的藥動學參數(shù)Table 2 The main pharmacokinetic parameters of TRE after taking the test or reference drugs in fasting and fed state

2.3 生物等效性評價

在空腹和餐后給藥條件下受試制劑和參比制劑主要藥動學參數(shù)lnAUC0-t及l(fā)nAUC0-∞的幾何均數(shù)比值90%置信區(qū)間均在80.00%～125.00%范圍內，空腹及餐后給藥條件下lnCmax幾何均數(shù)比值的90%置信區(qū)間上限超出了可接受80.00%～125.00%等效范圍內，并經(jīng)雙單側t-檢驗分析后，高側P值>0.05，則接受H0拒絕H1，即兩制劑在本試驗餐后給藥條件下Cmax不具有生物等效性，見表3。

表3 空腹組和餐后組受試者單次口服琥珀酸曲格列汀片受試制劑(T)和參比制劑(R)的90%置信區(qū)間 (n=8)Table 3 The 90% CIs for the main pharmacokinetic parameters of TRE after taking the test or reference drugs in fasting and fed state

2.4 安全性評價

空腹試驗8例受試者全部按計劃完成給藥、采血和安全性評價，并進入安全性分析集。共2例受試者發(fā)生2例次不良事件，均系服用受試制劑發(fā)生不良事件。不良事件為高尿酸血癥、腸炎，嚴重程度均為Ⅰ級(NCI CTCAE4.03)，未進行任何治療，均恢復正常。

餐后試驗8例受試者全部按計劃完成給藥、采血和安全性評價，并進入安全性分析集。共4例受試者發(fā)生5例次不良事件，其中服用受試制劑的8例受試者中發(fā)生2例次不良事件；服用參比制劑的8例受試者中發(fā)生3例次不良事件。不良事件為口腔黏膜炎、尿路感染、黃疸、腸炎，所有不良事件嚴重程度均為Ⅰ級，未進行任何治療，均恢復正常。

本研究無嚴重不良事件，無受試者因不良事件退出試驗，琥珀酸曲格列汀片(100 mg)受試制劑及參比制劑均具有較好的安全性。

3 討論

本研究建立了健康人血漿中曲格列汀LC-MS/MS測定方法。參照CFDA《以藥動學參數(shù)為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則》以及琥珀酸曲格列汀片原研說明書，確定生物樣品測定的目標待測物為曲格列汀。生物樣本前處理采用乙腈蛋白沉淀法，操作簡單，耗時短，適用于高通量樣本檢測；采用卡馬西平作為內標，價格便宜、易得，且與待測物曲格列汀有相似的理化性質，可以有效減少基質效應、回收率等導致檢測結果不可靠的情況。采用LC-MS/MS(ESI+離子化，MRM模式)方法，具有選擇性強，分析時間快，自動化程度高，檢測限低等優(yōu)點。經(jīng)方法學驗證本法符合2015年版《中國藥典》中“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的相關要求，可用于臨床試驗血漿樣品的分析檢測。

曲格列汀為生物藥劑學分類系統(tǒng)第三類藥物(BCS Ⅲ類：高溶解性，低滲透性)，藥物滲透性是這類藥物吸收的限速步驟，且胃腸道滯留時間和管腔組成以及膜滲透性的個體差異均會影響藥物在體內吸收[11-12]。研究顯示，餐后給藥相比于空腹給藥，受試制劑Cmax減少了2.98%，AUC0-t和AUC0-∞沒有明顯變化；參比制劑Cmax沒有明顯變化，AUC0-t和AUC0-∞分別增加了5.04%、5.36%，空腹和餐后各藥動學參數(shù)個體內變異相似。本研究結果顯示，巢湖今辰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的琥珀酸曲格列汀片空腹和餐后給藥條件下吸收速度和程度與參比制劑基本一致，主要藥動學參數(shù)與參比制劑說明書報道相近。本研究中空腹及餐后采血點在3.5 h均有分布，建議在正式試驗時增加3.5 h采樣點；截取72 h后分析的結果，AUCt/AUCi已超過95%，正式試驗可設計采血終點為72 h 。綜上所述，建議正式試驗采血點可設計為給藥前0 h及給藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0 h，共計19個采樣點。本研究中未參考FDA關于降糖藥服藥指南使用葡萄糖水送服藥物，未出現(xiàn)低血糖反應，因此正式試驗仍可考慮不用葡萄糖水送服。本研究中實際測得Cmax的CV值較大，在8例受試者的樣本量下無法滿足等效結果，根據(jù)本研究空腹/餐后受試者中的Cmax個體內變異(Intra-subject CV)系數(shù)、θ值以及實際臨床過程中考慮20%脫落率，采用 PASS11.0 樣本量統(tǒng)計軟件預估滿足生物等效條件所需的最低試驗樣本量空腹為28例、餐后為30例。