梅穎，胡輝，鄶一賀，譚文

(廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006)

質(zhì)譜成像是指將質(zhì)譜檢測(cè)與病理圖像相結(jié)合，應(yīng)用于解析樣品表面多種分子化學(xué)組成及各組分的空間立體結(jié)構(gòu)信息的一種新型分子影像技術(shù)，該技術(shù)具有較高的靈敏度和較寬的質(zhì)量檢測(cè)范圍，尤其在檢測(cè)組織中脂類等小分子的優(yōu)勢(shì)明顯。

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MADLI-MSI)最先由美國(guó)科學(xué)家 Caprioli等[1]提出。通過(guò)選擇合適的基質(zhì)將 MADLI-MSI 噴灑在組織切片的表面上，并通過(guò)激光照射使樣品與基質(zhì)形成共晶，基質(zhì)從激光吸收能量而將其傳遞給生物分子[2]。生物分子隨后被電離，離子在電場(chǎng)的作用下陸續(xù)飛過(guò)飛行管，并根據(jù)到達(dá)探測(cè)器的飛行時(shí)間進(jìn)行各個(gè)離子的檢測(cè)。同時(shí)待測(cè)離子的質(zhì)荷比與離子的飛行時(shí)間成比例。質(zhì)譜軟件根據(jù)切片的大小將圖像劃分為由若干點(diǎn)組成的二維晶格，并且計(jì)算機(jī)虛擬掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)以形成組織的二維離子密度圖像。將每個(gè)點(diǎn)處的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理以獲得表示該區(qū)域中化合物分布的質(zhì)譜圖。最后由所有數(shù)據(jù)集可獲得組織切片的化學(xué)成分和空間分布信息[3]?；衔锏南鄬?duì)豐度由峰高或峰面積表示，相對(duì)豐度由亮度強(qiáng)度或不同顏色圖案表示。此技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的發(fā)展，目前可實(shí)現(xiàn)從蛋白質(zhì)[4]、多肽[5]等生物大分子到脂類[6]等中分子量生物分子和小分子藥物的分析[7]， 雖然在國(guó)外該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)研究的許多領(lǐng)域但在國(guó)內(nèi)由于儀器設(shè)備的限制，用該技術(shù)研究并不常見(jiàn)。

脂質(zhì)組學(xué)是對(duì)生物體中的細(xì)胞、組織和器官相互作用的脂質(zhì)和分子的全面和系統(tǒng)的分析。多種研究表明脂質(zhì)與各種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但由于脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性，想要探究脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步了解脂質(zhì)與人體病理學(xué)和生理學(xué)的關(guān)系顯得相當(dāng)困難。 近幾年在脂質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用高分辨率質(zhì)譜技術(shù)能夠快速、高通量地分析各種生物脂質(zhì)成分，進(jìn)行大規(guī)模的整體脂質(zhì)組學(xué)分析。

本研究運(yùn)用MADLI-MSI質(zhì)譜成像技術(shù)，對(duì)大鼠高血脂造模后的腦組織標(biāo)本進(jìn)行了分析，目的尋找能夠闡述病變過(guò)程的潛在生物分子以及高脂模型中的可能脂質(zhì)改變，并進(jìn)一步通過(guò)生物分子之間可能的內(nèi)在相關(guān)性進(jìn)行探討，闡述并發(fā)現(xiàn)潛在標(biāo)志物分子的生物學(xué)意義并為其他類似研究提供新的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量100～120 g,周齡5～6周。購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041。高脂高膽固醇飼料購(gòu)于北京博宏達(dá)生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)試劑：基質(zhì) DHB、9-AA購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙醇、聚丙烯胺標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Fisher公司；三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器和儀器參數(shù)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器 US 2016/0278400A1 image PreP噴灑(德國(guó)Bruker)；rapifle X MADLI-TOF/(德國(guó)Bruker)； Enspire酶標(biāo)儀(鉑金埃爾墨公司)。

1.2.2 儀器參數(shù) MADLI-IMS 測(cè)定條件：(1)正離子模式：質(zhì)譜采集范圍為600～1 200；采集模式為反射模式；分辨率為50 μm； 激光光斑數(shù)為 300/pixel；激光聚焦設(shè)置為 M5 small；離子源 1 電壓為 20 kV； 反射器 1 電壓為 20.9 kV；反射器 2 電壓為 1.085 kV；反射器 3 電壓為 8.6 kV； 透鏡電壓為 11.6 kV。(2)負(fù)離子模式：質(zhì)譜采集范圍為600～1 200；采集模式為反射模式；分辨率為50 μm； 激光光斑數(shù)為 500/pixel；激光聚焦設(shè)置為 M5 small；離子源 1 電壓為 20 kV； 反射器 1 電壓為 20.9 kV；反射器 2 電壓為 1.085 kV；反射器 3 電壓為 8.6 kV； 透鏡電壓為 11.6 kV。

1.3 方法

1.3.1 大鼠高血脂模型的建立和取材 SD大鼠在進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周， 在適應(yīng)性喂養(yǎng)期間對(duì)其進(jìn)行觀察，若出現(xiàn)厭食、體質(zhì)量明顯下降情況，及時(shí)剔除問(wèn)題大鼠，不進(jìn)行建模試驗(yàn)。7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，隨機(jī)挑取24只分為正常組12只，高脂模型組(HFD)12只。 模型組大鼠進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)5周，飼料的配方為：豬油 10% ，蛋黃粉5%，膽固醇 2%，三號(hào)膽鹽0.5%，維持底料 82.5%。5周后禁食不禁水12 h采用眼靜脈叢采血。分離血清測(cè)定血清中TG、TC等血脂含量，若血脂顯著高于正常組大鼠說(shuō)明高脂建模成功可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。取成模后的大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)5周，其飼料配方為：豬油 10% ，蛋黃粉5%，三號(hào)膽鹽0.5%，維持底料 82.5%。到第10周時(shí)，采血，分離血清測(cè)定TG、TC等血脂含量，采用摘眼球法在鼠的右側(cè)眼球根部摘去眼球收取血液安樂(lè)死動(dòng)物，用左手持鉤鑷插入大鼠的眼眶固定顱骨，后用彎鉗直接夾住枕骨大孔處的骨頭，直接就掀起取出腦組織冷凍、切片，進(jìn)行質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 生化指標(biāo)的檢測(cè) 參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定TG、 FFA、TC 水平。

1.3.3 腦組織切片的制作 將腦組織從冰箱取出后，移入切片機(jī)內(nèi)，放置 20 min，然后在冷凍切片機(jī)中進(jìn)行冰凍切片。將每例標(biāo)本在手動(dòng)模式下切出厚度為 10 μm 的切片用于 MADLI-MSI 成像，可將切片儲(chǔ)存于超低溫冰箱備用。

1.3.4 樣本組織預(yù)處理 將冰凍的切片置于真空干燥器中，干燥大約 30 min，待切片表面無(wú)明顯的水份即可用于下一步實(shí)驗(yàn)。在玻片上做好標(biāo)記，用紙片將標(biāo)記遮住，待成像時(shí)這些標(biāo)記可用于坐標(biāo)定位。將 30 mg/mL 的 DHB 溶液使用 Image Prep 噴灑儀將基質(zhì)溶液噴灑到組織片上，以此作為采集正離子信號(hào)的樣本；將 10 mg/mL的9-AA 溶液使用 Image Prep 噴灑到組織片上，作為采集負(fù)離子信號(hào)的樣本。由于采集的主要是脂類分子的信號(hào)，而在此條件下，脂類分子的相對(duì)豐度較高，故腦組織可不用作其他的預(yù)處理。

1.3.5 質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的采集 切片采用 MADLI-MSI 進(jìn)行成像處理分析。MADLI-MSI 成像時(shí)，在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用全掃描模式，掃描范圍設(shè)定在 600～1 200；數(shù)據(jù)采集分別釆用了數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及儀器控制及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。在數(shù)據(jù)采集前，需要對(duì)切片進(jìn)行噴基質(zhì)處理，然后將切片送入質(zhì)譜儀，隨后用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正，并調(diào)整激光能量，使所采集質(zhì)譜峰的分辨率達(dá)到 10 000，質(zhì)譜峰信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到 104級(jí)別，待方法達(dá)到要求后可保存該方法用于組織成像數(shù)據(jù)的采集，然后在組織成像軟件中設(shè)置要采集的切片位置和范圍，最后開(kāi)始采集樣品表面組織的質(zhì)譜信號(hào)。

1.3.6 質(zhì)譜成像分析與數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理過(guò)程包括分割分析、多變量統(tǒng)計(jì)分析和 ROC 分析等幾個(gè)過(guò)程。首先檢測(cè)獲得原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)文件(.mis 格式)轉(zhuǎn)換成為數(shù)據(jù)分析格式(.sl 格式)，之后將格式的文件采用成像軟件 SCiLS Lab 批量處理,進(jìn)行上述的分割分析、多變量統(tǒng)計(jì)分析和 ROC 分析并輸出。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,組間差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高血脂模型的評(píng)價(jià)

高血脂模型組與正常組比較， FFA、TC、TG 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明大鼠高血脂模型建立成功。見(jiàn)表1。

表1 血清中TC、TG、 FFA的含量Table 1 Contents of TG,TC and FFA in serum c/(mmol·L-1)

2.2 高血脂模型腦組織切片 MADLI-MSI 成像數(shù)據(jù)分析

結(jié)果見(jiàn)圖1。高血脂模型組的腦組織與正常組相比，未見(jiàn)明顯的差別。利用 SCiLS lab 軟件進(jìn)行分割分析，選擇整片腦作為感興趣的分析區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)果不管是在正離子(Positive ion mode)或者負(fù)離子模式(Negative ion mode)下，正常組和高血脂模型組均未見(jiàn)到明顯的特征差異。

圖1 大鼠腦片正常組和高血脂組MADLI-MSI 成像分割分析結(jié)果Figure 1 Results of MADLI-MSI image segmentation analysis

2.3 腦切片主成份分析(PCA 分析)

從圖2可以看出兩者在分布行為上相似，通過(guò) PCA 分析不能將兩組分開(kāi)，故沒(méi)有差異分子使兩組數(shù)據(jù)產(chǎn)生差異。

A.正常組腦組織切片平均質(zhì)譜圖； B.高血脂組腦組織切片平均質(zhì)譜圖。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用 MADLI-MSI 質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型的腦組織進(jìn)行了質(zhì)譜成像和數(shù)據(jù)分析，主要內(nèi)容包括正負(fù)離子檢測(cè)模式下獲得高血脂模型腦組織切片中的脂類分子信息，通過(guò)成像軟件選取各標(biāo)本中的感興趣區(qū)域，對(duì)各切片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并進(jìn)行PCA分析研究。通過(guò)對(duì)腦組織切片進(jìn)行分組對(duì)比，探究與疾病病理進(jìn)程和藥物干預(yù)相關(guān)的差異分子信息。

對(duì)高血脂大鼠模型的腦組織分析結(jié)果表明在給予高脂喂食后，腦部的脂類分布未見(jiàn)顯著的改變，說(shuō)明在高脂誘導(dǎo)大鼠10周時(shí)其外周血液里的高血脂水平并不會(huì)影響到腦部脂類的分布改變，而Kothari 等[8]研究表明，高脂喂養(yǎng)14周C57BL/6NHsd 小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腦部受損出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。另外，最近也有類似文獻(xiàn)報(bào)道，高脂喂養(yǎng)小鼠19周后通過(guò)GC-MS分析腦部脂質(zhì)的分布發(fā)現(xiàn)有明顯的變化[9]。分析原因可能是目前本研究的工作只是對(duì)10周高血脂大鼠進(jìn)行腦片掃描分析，誘導(dǎo)周期短沒(méi)有達(dá)到腦部損傷程度。具體如何后續(xù)工作還有待進(jìn)一步研究。

本文研究結(jié)果為臨床腦部研究提供了一定的理論依據(jù)，同時(shí)本文采用前沿MADLI-MSI質(zhì)譜成像技術(shù)方法也為其他類似研究提供借鑒意義。