曾杉，甘偉發(fā)，史紫娟

(國(guó)藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

大棗(ZiziphusjujubaMill.)俗名又稱紅棗，是鼠李科植物棗的成熟果實(shí)，臨床上具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血安神的效果，具有很高的食用和藥用價(jià)值。大棗在中藥復(fù)方中入藥的歷史十分悠久，在《傷寒論》、《本草綱目》、《千金翼方》等多部古籍中均有入藥記載?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大棗在抗腫瘤、改善心腦血管系統(tǒng)、增強(qiáng)人體免疫力和造血功能等方面均有明顯藥效[1-2]。大棗化學(xué)成分復(fù)雜，含有多達(dá)上百種成分，主要成分為核苷酸類、生物堿類、皂苷類、黃酮類、糖類化合物等，其中包括環(huán)磷腺苷(cAMP)、尿嘧啶、鳥苷、蘆丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多種化學(xué)成分[3]。

中藥配方顆粒是飲片采用傳統(tǒng)水煎煮方式提取后通過現(xiàn)代成型工藝制備所得的顆粒制劑，具有服用、貯藏方便且易于攜帶等諸多優(yōu)點(diǎn)。中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高需深入開展藥材飲片特征圖譜研究，并建立原料質(zhì)量控制體系[4]。環(huán)磷腺苷(cAMP)是大棗的主要水溶性成分之一，果實(shí)中含量最高，在生理生化過程中作為反向調(diào)節(jié)的第二信使，在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用。美國(guó)藥典委員會(huì)出版的《草藥法典》(Herbal Medicines Compendium)標(biāo)準(zhǔn)集中收載了大棗的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)以環(huán)磷腺苷為含量測(cè)定指標(biāo)并規(guī)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.010%。目前，對(duì)于大棗藥材指紋圖譜和含量研究文獻(xiàn)相對(duì)甚少[5-7]，2015年版《中國(guó)藥典》制定的大棗藥材標(biāo)準(zhǔn)中僅通過性狀、顯微、薄層鑒別等項(xiàng)目控制大棗藥材的質(zhì)量，并無含量測(cè)定和指紋圖譜項(xiàng)[8]。本研究建立了15批不同產(chǎn)地大棗藥材的指紋圖譜和含量測(cè)定的UPLC法，完善和提高了大棗藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為提高大棗配方顆粒的質(zhì)量控制水平提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

H-class UPLC高效液相色譜儀(PDA二極管陣列檢測(cè)器，Water公司)；AL104 型電子天平(Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；M Millipore Synergy UV 超純水儀(美國(guó)默克公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品：環(huán)磷腺苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140709-201404)，蘆丁(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201610)，5-羥甲基糠醛(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111977-201501)，鳥苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111977-201501)；甲醇、乙腈為HPLC級(jí)，實(shí)驗(yàn)用其他試劑均為AR級(jí)。

1.3 樣品

15批大棗藥材(編號(hào)S1-S15)分別從河南、山東、山西、甘肅、河北等不同產(chǎn)地購得，其中編號(hào)S1-S3采集地點(diǎn)為山東省臨沂市平邑縣，編號(hào)S4-S6采集地點(diǎn)為河南省安陽市內(nèi)黃縣，編號(hào)S7-S9采集地點(diǎn)為甘肅省武威市民勤縣，編號(hào)S10-S12采集地點(diǎn)為山西省長(zhǎng)治市沁源縣，編號(hào)S13-S15采集地點(diǎn)為河北省滄州市滄縣，按2015年版《中國(guó)藥典》檢驗(yàn)均合格。

2 指紋圖譜方法的建立

2.1 色譜方法

色譜柱：Waters HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～3 min，0%B；3～12 min，0%→10% B；12～25 min，10%→20%B；25～30 min，20%→95%B)；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min；波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：1 μL；理論塔板數(shù)按環(huán)磷腺苷峰計(jì)應(yīng)不低于10 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取環(huán)磷腺苷、5-羥甲基糠醛、鳥苷、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加40%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇制成每1 mL分別含環(huán)磷腺苷50 μg、5-羥甲基糠醛20 μg、鳥苷50 μg、蘆丁20 μg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取大棗藥材粉末(過三號(hào)篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞量瓶中，精密加入40%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(500 W，40 kHz)20 min，取出，放冷，用40%甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，5 000 r/min離心5 min，取上清液，濾過，即得。

2.4 共有峰的確認(rèn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和“2.3”項(xiàng)下供試品溶液各1 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果顯示峰6、峰7、峰9和峰14保留時(shí)間分別與鳥苷、環(huán)磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁對(duì)照品保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)，見圖1。

圖1 對(duì)照品及大棗藥材的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC of reference substances and Ziziphus jujube

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一批藥材(編號(hào)：S4)按“2.3”項(xiàng)方法制備溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以環(huán)磷腺苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品(編號(hào)：S4)溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以環(huán)磷腺苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值均小于5.0%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材(編號(hào)：S4)，按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，以環(huán)磷腺苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值均小于5.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 中間精密度試驗(yàn) 取同一批藥材(編號(hào)：S4)，由不同實(shí)驗(yàn)人員在不同日期按“2.3”項(xiàng)方法平行制備6份樣品進(jìn)樣測(cè)定，以環(huán)磷腺苷為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1.0%，相對(duì)峰面積RSD值均小于5.0%，表明方法中間精密度良好。

2.6 指紋圖譜的測(cè)定

取15批不同產(chǎn)地的大棗藥材按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，將結(jié)果導(dǎo)入相似度軟件進(jìn)行擬合并生成對(duì)照指紋圖譜，選擇峰面積穩(wěn)定的色譜峰作為共有峰，最終確定14個(gè)穩(wěn)定的共有峰，并通過對(duì)照品指認(rèn)其中的鳥苷、環(huán)磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁4個(gè)已知峰，相似度計(jì)算結(jié)果顯示15批大棗藥材樣品的指紋圖譜相似度均高于0.90以上，表明不同產(chǎn)地的大棗藥材成分差異不大，質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)果見圖2、圖3和表1。

圖2 15批大棗藥材HPLC指紋圖譜疊加圖Figure 2 HPLC fingerprint of 15 batches of Ziziphus jujube

峰6.鳥苷； 峰7.環(huán)磷腺苷； 峰9. 5-羥甲基糠醛； 峰14.蘆丁。

表1 15批大棗藥材相似度分析結(jié)果Table 1 Results of similarities test of 15 batches of Ziziphus jujube

3 大棗藥材中環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

3.1 對(duì)照品溶液的制備

取環(huán)磷腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加40%甲醇制成每1 mL含環(huán)磷腺苷10 μg的溶液，即得。

3.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過三號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置具塞量瓶中，精密加入40%甲醇溶液10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(500 W，40 kHz)30 min，放冷后用40%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

3.3 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以甲醇-0.05 mol/L KH2PO4溶液溶液(體積比8∶92)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm；進(jìn)樣量為1 μL；流速為0.4 mL/min；柱溫為30 ℃。按上述色譜條件取對(duì)照品、空白溶劑和供試品溶液進(jìn)行，色譜圖見圖4。

圖4 環(huán)磷腺苷對(duì)照品、空白溶劑及大棗藥材的色譜圖Figure 4 HPLC of cAMP, blank control and Ziziphus jujube

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系考察 精密稱取環(huán)磷腺苷對(duì)照品10.73 mg，置50 mL量瓶中，加40%甲醇定容，作為儲(chǔ)備液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液稀釋成1.073、5.365、10.73、21.46、42.92 μg/mL的對(duì)照溶液，精密吸取各濃度對(duì)照品溶液1 μL，注入液相色譜儀，按“3.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、環(huán)磷腺苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程Y= 0.7 046X- 0.040 7，r=1.000 0，表明環(huán)磷腺苷質(zhì)量濃度在1.073～42.92 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.4.2 精密度試驗(yàn) 取大棗藥材(編號(hào)：S8)按“3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算環(huán)磷腺苷峰面積RSD值為0.09%，表明儀器精密度良好。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取新制備的供試品溶液(編號(hào)：S8)分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算環(huán)磷腺苷色譜峰峰面積RSD值為0.26%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大棗藥材(編號(hào)：S8)同法平行制備6份溶液進(jìn)樣，計(jì)算環(huán)磷腺苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為221 μg/g，其RSD值為0.49%，表明方法重復(fù)性良好。

3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取折干后量分?jǐn)?shù)為221 μg/g的大棗藥材粉末(編號(hào)：S8，水分：18.5%)約0.5 g，平行6份，各加入環(huán)磷腺苷對(duì)照品97.80 μg，按“3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2?？梢姡佘占訕悠骄厥章蕿?04.10%，RSD值為3.81%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 環(huán)磷腺苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery of cAMP

3.5 15批大棗藥材中環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 取15批不同產(chǎn)地大棗藥材樣品，按“3.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“3.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定環(huán)磷腺苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3?？梢?，15批不同產(chǎn)地的大棗的環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在101～441 μg/g之間，不同產(chǎn)地間的差異不大，以山西省、河南省、甘肅省的較高，山東省和河北省的較低。

表3 15批大棗藥材中環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of cAMP in 15 batches of Ziziphus jujube

4 討論

在指紋圖譜方法的建立中，分別進(jìn)行PDA檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描比較了不同波長(zhǎng)下的差異，考察了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸和甲醇-0.1%磷酸不同流動(dòng)相體系，并比較了25、30、35 ℃柱溫的差異，最終選擇30 ℃柱溫下、乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫、波長(zhǎng)254 nm的色譜條件。

由于環(huán)磷腺苷為水溶性成分，本研究在質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法的建立時(shí)考察了水、40%甲醇、70%甲醇和稀乙醇4種溶劑對(duì)環(huán)磷腺苷的提取效果，結(jié)果顯示40%甲醇提取效率最高；同時(shí)比較了超聲提取和回流提取2種提取方式對(duì)提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲處理30 min的提取效果更好，操作簡(jiǎn)單。指紋圖譜指認(rèn)了鳥苷、環(huán)磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁4個(gè)成分，由于環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到萬分之一以上，其余3個(gè)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于萬分之一，誤差較大，因此本研究以環(huán)磷腺苷作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定指標(biāo)，其他3個(gè)成分不作測(cè)定要求。

本研究測(cè)定了15批不同產(chǎn)地的大棗藥材UPLC指紋圖譜，共確定了14個(gè)特征峰，指認(rèn)了鳥苷、環(huán)磷腺苷、5-羥甲基糠醛和蘆丁4個(gè)已知峰，相似度計(jì)算結(jié)果顯示15批大棗藥材的指紋圖譜相似度均高于0.90以上。同時(shí)建立了大棗藥材中環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法，結(jié)果顯示15批不同產(chǎn)地的大棗的環(huán)磷腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在101～441 μg/g之間，不同產(chǎn)地間的差異不大，以山西省、河南省、甘肅省的較高，山東省和河北省的較低，與文獻(xiàn)[6]中山東大棗藥材含量(168 μg/g)基本相符。

綜上所述，本研究中建立大棗藥材指紋圖譜和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定的方法簡(jiǎn)單易操作，穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，可作為大棗藥材的質(zhì)量控制方法。