白家齊,孟 嬌,韓北忠,陳晶瑜*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

琥珀酸(succinic acid)學(xué)名丁二酸,屬于四碳二羧酸家族的一員,廣泛地存在于動(dòng)物、植物和微生物中[1]。琥珀酸及其衍生物被廣泛地應(yīng)用于食品,制藥和化妝品等領(lǐng)域。琥珀酸的發(fā)酵潛力早在1980年就得到認(rèn)可,在美國(guó)能源部公布的12種有潛力可大宗生產(chǎn)的化合物中,琥珀酸居于第一位[2],目前生產(chǎn)琥珀酸的方法主要有化學(xué)法和生物法,其中化學(xué)法仍然是琥珀酸生產(chǎn)的主要方法[3]。但是化學(xué)法生產(chǎn)的過(guò)程中污染大、成本高,不符合如今倡導(dǎo)的可持續(xù)發(fā)展原則,生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸因具有資源可再生及吸收CO2等優(yōu)點(diǎn)而擁有廣闊的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

琥珀酸鹽作為三羧酸循環(huán)(tricarboxylicacidcycle,TCA)中的中間體之一,可以由許多微生物合成:產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)[4],產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens)[5],谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)[6],釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[7],大腸桿菌(Escherichia coli)等,由于生長(zhǎng)速度快,基因信息清楚,基因操作簡(jiǎn)單,營(yíng)養(yǎng)需要量極小,大腸桿菌已被廣泛研究用于琥珀酸的生產(chǎn)[8]。

為了提高大腸桿菌產(chǎn)琥珀酸的能力,研究人員已經(jīng)探索了多種代謝工程策略[9-11],如激活糖酵解途徑(embden meyerhof pathway,EMP)、過(guò)表達(dá)丙酮酸代謝酶、消除競(jìng)爭(zhēng)途徑、并提供還原當(dāng)量和能量等[12-15]。本文介紹代謝控制發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸方面的研究進(jìn)展,以期對(duì)今后的發(fā)展提供新思路。

1 消除競(jìng)爭(zhēng)途徑

1.1 敲除競(jìng)爭(zhēng)性副產(chǎn)物

如圖1所不,在厭氧條件下,大腸桿菌進(jìn)行混合酸的發(fā)酵,生成大量的乙酸、乳酸、甲酸和乙醇,乃積累少量的琥珀酸。這些副產(chǎn)物的生物合成不僅消耗碳源,而且還消耗限制琥珀酸生產(chǎn)的煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide,NAD+)。因此,大腸桿菌的代謝工程必須關(guān)注阻斷副產(chǎn)物生物合成途徑[6]。JANTAMA K等[16]以KJ091為出發(fā)菌株敲除tdcD(編碼蘇氨酸脫羧酶)和tdcE(編碼2-酮丁酸甲酸裂解酶)后,乙酸的含量減少了50%,琥珀酸的得率達(dá)到1.3 mol/mol。在此基礎(chǔ)上,接著敲除aspC(編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)和sfcA(編碼NAD+依賴(lài)的蘋(píng)果酸酶),琥珀酸的產(chǎn)量和得率分別提高至700 mmol/L和1.5 mol/mol。

圖1 厭氧條件下大腸桿菌生物合成琥珀酸的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of succinate biosynthesis in E.coli under anaerobic conditions

1.2 失活磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)是合成許多工業(yè)化學(xué)物(如琥珀酸,蘋(píng)果酸和芳香族化合物)的重要前體物。然而在大腸桿菌中,葡萄糖主要是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(phosphoenolpyruvate transport system,PTS)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中,其中有一半的PEP被用于葡萄糖的攝取和磷酸化。失活PTS系統(tǒng),提高PEP前體物的供給,是提高代謝流通向目標(biāo)產(chǎn)品琥珀酸的重要代謝工程策略。然而,PTS突變的菌株在生長(zhǎng)和糖耗方面表現(xiàn)得非常緩慢,這樣的發(fā)酵特點(diǎn)不適用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。ptsG基因突變的菌株P(guān)B11通過(guò)代謝進(jìn)化后提高了糖耗的速率,研究發(fā)現(xiàn)半乳糖透性酶-葡萄糖激酶(galactose permease-glucokinase,Galp-Glk)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)成為了該菌株葡萄糖的攝取和磷酸化的主要途徑[17]。TANG J等[18]在菌株XZ-T108(ΔptsI ΔldhAΔpflB,Pck)中組合調(diào)控大腸桿菌自身的galp(編碼半乳糖透性酶)和glk(編碼葡萄糖激酶)后,葡萄糖的利用率得到了提高,琥珀酸的產(chǎn)量從156mmol/L提高至187mmol/L,生產(chǎn)速率從0.19 g/(L·h)提高至0.22 g/(L·h)。

2 過(guò)表達(dá)自身或外源的關(guān)鍵酶

2.1 過(guò)表達(dá)內(nèi)源羧化酶

在PEP下游有兩種代謝途徑:通過(guò)固定一個(gè)分子的CO2,PEP(C3)可以轉(zhuǎn)化為草酰乙酸(oxaloacetate,OAA)(C4),并且草酰乙酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為琥珀酸;PEP也可用于生產(chǎn)丙酮酸鹽,導(dǎo)致副產(chǎn)物乙酸鹽,甲酸鹽,乙醇和乳酸鹽的形成。因此,C4化合物的合成對(duì)琥珀酸生產(chǎn)是重要的。大腸桿菌自身有4種羧化酶:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK)和兩種蘋(píng)果酸酶(malic enzyme,Mae)A和B。MILLARDCS等[19]在菌株JCL1208的基礎(chǔ)上,采用誘導(dǎo)型質(zhì)粒過(guò)表達(dá)大腸桿菌自身的PPC,PPC酶活力提高了8.57倍,琥珀酸的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量分別提高了3.75和3.50倍;相反,過(guò)表達(dá)大腸桿菌自身的PCK則對(duì)琥珀酸產(chǎn)量沒(méi)有明顯的提高。STOLSL等[20]在NZN111菌株中過(guò)表達(dá)大腸桿菌本身的MaeA,琥珀酸的產(chǎn)量較出發(fā)菌提高了6倍。在菌株K-12中過(guò)表達(dá)自身MaeB,使得重組大腸桿菌的琥珀酸產(chǎn)量提高至15.4mmol/L,比出發(fā)菌株增強(qiáng)了1.4倍[21]。TAN Z等[22]通過(guò)組合優(yōu)化PPC和PCK兩個(gè)酶的表達(dá)提高了琥珀酸的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn),PCK的活力和琥珀酸的產(chǎn)量有正相關(guān)性,而PPC乃有在特定的酶活力范圍內(nèi)PPC活力和琥珀酸的合成呈正相關(guān)性,超過(guò)這個(gè)界定范圍,細(xì)胞的生長(zhǎng)和琥珀酸的形成就會(huì)顯著下降。通過(guò)對(duì)PPC和PCK的組合優(yōu)化,最優(yōu)菌株琥珀酸的產(chǎn)量提高了近70倍,琥珀酸的得率達(dá)到了1.12 mol/mol。

2.2 過(guò)表達(dá)外源羧化酶

現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中,被研究最多的外源羧化酶就是丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK)。雖然在大腸桿菌中PCK催化的反應(yīng)主要是糖異生,但是在一些高產(chǎn)琥珀酸的瘤胃細(xì)菌里PCK卻是主要的羧化酶。厭氧條件下,葡萄糖經(jīng)EMP途徑再經(jīng)TCA還原臂生成琥珀酸的途徑中是沒(méi)有凈ATP產(chǎn)生的,為了解決厭氧條件下菌體的維持能,引入ATP依賴(lài)性的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)成為大腸桿菌主要的羧化酶是一個(gè)重要的代謝工程策略。KIM P等[23]在大腸桿菌K-12中過(guò)表達(dá)來(lái)自產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的PCK后,琥珀酸的產(chǎn)量并沒(méi)有明顯的變化,這可能是由于大腸桿菌自身PPC的高活力所導(dǎo)致的。然而,在PPC突變的菌株中過(guò)表達(dá)產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的PCK后,琥珀酸的產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了6.5倍。

3 提高NADH的供給

在厭氧的條件下,一分子葡萄糖經(jīng)過(guò)EMP途徑能產(chǎn)生兩分子的還原型輔酶Ⅰ(nicotinamideadeninedinucleotide,NADH)和兩分子磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),然而經(jīng)TCA還原臂生成一分子琥珀酸則需要一分子的PEP和兩分子的NADH,所以葡萄糖經(jīng)這條途徑的理論得率乃有1 mol/mol葡萄糖,為了提高NADH的供給,目前以甘油為底物產(chǎn)琥珀酸、激活乙醛酸途徑和表達(dá)外源的甲酸脫氫酶已經(jīng)得到了應(yīng)用。

3.1 利用甘油為底物產(chǎn)琥珀酸

甘油是生物柴油生產(chǎn)的主要副產(chǎn)品。隨著生物柴油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,如何將甘油轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)品已成為亟待解決的問(wèn)題。作為糖異生碳源之一,甘油具有高還原性,因此有利于產(chǎn)生琥珀酸等還原產(chǎn)物。其天然pck基因在雙重突變體大腸桿菌菌株MLB(ΔldhA和ΔpflB)中的過(guò)表達(dá)顯著提高了甘油利用率和琥珀酸產(chǎn)量。與對(duì)照相比,甘油消耗量從2.2 g/L增加至35.8 g/L,琥珀酸產(chǎn)量從2.5 g/L增加至42.5 g/L[8]。BLANKSCHIEN M D等[24]通過(guò)代謝工程使得大腸桿菌在微氧下利用甘油產(chǎn)琥珀酸。首先失活競(jìng)爭(zhēng)途徑的幾個(gè)關(guān)鍵基因ldhA、adhE和pflB,隨后引入來(lái)自乳酸菌的丙酮酸羧化酶(PYC),琥珀酸的產(chǎn)率和得率分別達(dá)到了400 mg/(g·h)和0.69 g/g甘油。ZHANGX等[25]在已構(gòu)建好的產(chǎn)琥珀酸的菌株上,通過(guò)失活pflB和ptsI基因,強(qiáng)化pck基因的表達(dá),重組后的菌株利用甘油為底物產(chǎn)琥珀酸,琥珀酸的得率達(dá)到了理論最大得率的80%。

3.2 激活乙醛酸途徑

在大腸桿菌的代謝途徑中,有兩條路徑能形成琥珀酸。一條是在完全厭氧的條件下較為活躍的TCA還原臂,另一條則是在好氧條件下較為活躍的乙醛酸支路。乙醛酸循環(huán)催化一分子的草酰乙酸和兩分子的乙酰輔酶A形成一分子的琥珀酸和一分子的蘋(píng)果酸,生成的這一分子蘋(píng)果酸再與一分子的NADH形成一分子的琥珀酸,總得來(lái)說(shuō),消耗一分子的NADH能形成兩分子的琥珀酸。研究表明,當(dāng)71.4%的碳流量通向TCA還原臂,28.6%的碳流量通向乙醛酸支路,琥珀酸得率能達(dá)到最大理論得率1.714 mol/mol[26]。研究發(fā)現(xiàn),在厭氧條件下敲除乙酸合成基因ackA和pta對(duì)激活乙醛酸途徑起到了關(guān)鍵的作用。敲除ldhA、ptsG和ackA-pta基因,重組菌株YJ003琥珀酸的產(chǎn)量能達(dá)到150.78 mmol/L,相比對(duì)照菌株提高了5倍[27]。

3.3 表達(dá)外源的甲酸脫氫酶

甲酸脫氫酶能催化一分子的甲酸形成一分子的CO2和一分子的NADH,引入外源的甲酸脫氫酶不僅能為琥珀酸的合成提供額外的還原力,加強(qiáng)琥珀酸的合成能力,同時(shí)還能降低副產(chǎn)物甲酸的積累,有助于下游產(chǎn)品的分離純化。BALZERGJ等[28]將假絲酵母中NAD+依賴(lài)型的甲酸脫氫酶基因fdh1引入大腸桿菌SBS550MG中,重組后的菌株琥珀酸的產(chǎn)率從1.4 g/(L·h)提高至2 g/(L·h),甲酸從17mmol/L減少至0～3 mmol/L。LITSANOV B等[29]將來(lái)自分支桿菌的甲酸脫氫酶基因fdh引入產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌中,重組菌株BOL-3/pAN6-gap在以葡萄糖為單一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),琥珀酸的得率達(dá)到1.07 mol/mol,當(dāng)發(fā)酵液中添加一定量的甲酸后,琥珀酸的得率提高到1.41 mol/mol。

4 擾動(dòng)磷酸戊糖途徑(PPP途徑)

磷酸戊糖途徑(pentosephosphatepathway,PPP)途徑產(chǎn)生的還原力是煙酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸(nicotinamide adeninedinucleotidephosphate,NADPH),而琥珀酸的合成則需要煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(NADH),通過(guò)擾動(dòng)PPP途徑來(lái)提高琥珀酸的生物合成還需要體內(nèi)轉(zhuǎn)氫酶的參與,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)輔因子NADPH和NADH的相互轉(zhuǎn)化。在大腸桿菌中存在兩種類(lèi)型的轉(zhuǎn)氫酶,它們分別是能量依賴(lài)型的膜定位嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶(PntAB)和非能量依賴(lài)型的可溶性轉(zhuǎn)氫酶(UdhA)。當(dāng)胞內(nèi)NADPH的濃度較低時(shí),PntAB催化NADH和NADP+生成NADPH和NAD+,反之,當(dāng)胞內(nèi)NADPH的濃度較高時(shí),UdhA則催化NADPH和NAD+生成NADH和NADP+[30]。MENG J等[14]將參與谷氨酸棒狀桿菌產(chǎn)生NADPH的解調(diào)基因zwf243(編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)和gnd361(編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶)導(dǎo)入大腸桿菌以產(chǎn)生琥珀酸,有益于突變脫氫酶的共表達(dá),其去除了PPP途徑氧化部分中的反饋抑制,將琥珀酸產(chǎn)量從1.01 mol/mol葡萄糖增加至1.16 mol/mol葡萄糖。然后過(guò)表達(dá)了3個(gè)關(guān)鍵基因,pgl(編碼6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶)、tktA(編碼轉(zhuǎn)酮酶)和talB(編碼轉(zhuǎn)醛酶)以重定向更多的碳流向PPP途徑,并進(jìn)一步將琥珀酸得率提高至1.21 mol/mol。

5 強(qiáng)化琥珀酸的輸出

產(chǎn)物的輸出對(duì)于提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量和得率是非常重要的。在厭氧條件下,E.coli四碳二羧酸的攝取,運(yùn)輸和輸出主要是依靠體內(nèi)的Dcu轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Dcu轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要包含4種運(yùn)輸?shù)鞍?它們分別是DcuA、DcuB、DcuC、DcuD。DcuA和DcuB是兩個(gè)同源蛋白,它們能夠獨(dú)立地或相互地作用大腸桿菌體內(nèi)冗余的四碳二羧酸的輸出,研究表明DcuB運(yùn)輸?shù)鞍椎闹饕δ苁谴呋奶级人岬慕粨Q,例如催化延胡索酸轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁醄31],然而DcuA確切的生理功能至今還未見(jiàn)報(bào)道。盡管DcuC蛋白能協(xié)助DcuA和DcuB蛋白去完成延胡索酸的攝取和延胡索酸與琥珀酸的交換,但是已有報(bào)道指出DcuC蛋白的主要功能卻是協(xié)助在厭氧條件下以葡萄糖為碳源時(shí)琥珀酸的胞內(nèi)到胞外的輸出[32]。DcuD雖然是DcuC的同源蛋白,但是DcuD在體內(nèi)大多情況下是不被表達(dá)的,所以DcuD的主要生理功能至今也不清楚[33]。CHEN J等[34]以大腸桿菌Suc-T110為出發(fā)菌株,首先分別敲除編碼Dcu運(yùn)輸?shù)鞍椎幕?dcuA、dcuB、dcuC、dcuD,結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除dcuA和dcuD基因后,琥珀酸的產(chǎn)量和得率幾乎沒(méi)有變化。敲除dcuB和dcuC基因后,琥珀酸的產(chǎn)量分別下降了15%和11%。然而,同時(shí)敲除dcuB和dcuC這兩個(gè)基因后,琥珀酸的產(chǎn)量下降了90%。該研究表明當(dāng)以葡萄糖為單一碳源時(shí),DcuB和DcuC是大腸桿菌體內(nèi)琥珀酸胞內(nèi)到胞外輸出的兩個(gè)關(guān)鍵蛋白。隨后,對(duì)DcuB和DcuC這兩個(gè)運(yùn)輸?shù)鞍椎腞BS進(jìn)行組合優(yōu)化,琥珀酸的產(chǎn)量從273 mmol/L提高至366 mmol/L,琥珀酸的得率從1.12 mol/mol提高至1.41 mol/mol。

6 代謝進(jìn)化

代謝進(jìn)化作為一種有價(jià)值的方法已經(jīng)被廣泛用于菌株發(fā)育和優(yōu)化,這不僅可以導(dǎo)致潛在途徑的激活,而且還會(huì)導(dǎo)致突變株的期望表型和環(huán)境適應(yīng)性的改善[35]。JANTAMA K等[36]在野生型的E.coli ATCC 8739的基礎(chǔ)上,結(jié)合代謝工程和代謝進(jìn)化,篩選到琥珀酸生產(chǎn)最優(yōu)的兩株菌KJ060(ΔldhAΔadhEΔackAΔfocA ΔpflB)和KJ073(ΔldhAΔadhE ΔackAΔfocAΔpflBΔmgsAΔpoxB),在以葡萄糖為單一碳源時(shí),琥珀酸的產(chǎn)量達(dá)到622～733 mmol/L,得率達(dá)到1.2～1.6 mol/mol。ZHU X等[37]通過(guò)代謝進(jìn)化得到一株高產(chǎn)琥珀酸的菌株HX024,在以基本鹽為培養(yǎng)基時(shí)該菌株琥珀酸的產(chǎn)量達(dá)到了813 mmol/L,琥珀酸的得率達(dá)到1.36 mol/mol。通過(guò)全基因組測(cè)序,轉(zhuǎn)錄組學(xué)及酶學(xué)的分析,lpdA基因中有三個(gè)核苷酸的突變,該基因的突變解除了丙酮酸脫氫酶對(duì)NADH的抑制作用,丙酮酸脫氫酶的活力提高,提供更多NADH用于琥珀酸的合成。除此之外,磷酸戊糖途徑中的轉(zhuǎn)酮酶(TktA)以及轉(zhuǎn)氫酶(SthA)的活力也得到了相應(yīng)的提高。結(jié)合逆向代謝工程,在野生型的大腸桿菌中過(guò)表達(dá)磷酸戊糖途徑中的tktA及sthA,琥珀酸的得率從1.12mol/mol提高到1.33 mol/mol。

7 展望

控制微生物代謝發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)琥珀酸有著不可替代的優(yōu)勢(shì),另外產(chǎn)品更加適用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥等與人類(lèi)健康密切相關(guān)的行業(yè),具有巨大的生產(chǎn)潛力,目前為止通過(guò)多種基因策略來(lái)提高琥珀酸生物合成的嘗試是成功的,但是仍然達(dá)不到工業(yè)化大生產(chǎn)所需要的效率和強(qiáng)度,為了能夠?qū)崿F(xiàn)琥珀酸生物合成工業(yè)化,依然需要深入研究大腸桿菌琥珀酸代謝途徑、過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶、強(qiáng)化輸出、代謝進(jìn)化等,綜合利用強(qiáng)化琥珀酸合成途徑來(lái)構(gòu)建新的產(chǎn)琥珀酸途徑,開(kāi)發(fā)出具有產(chǎn)業(yè)化前景的產(chǎn)琥珀酸基因工程菌株,同時(shí)隨著系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)等的不斷發(fā)展,琥珀酸的生物合成定會(huì)充分體現(xiàn)出環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益,也將推動(dòng)發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)業(yè)化,生產(chǎn)出更具優(yōu)勢(shì)的琥珀酸產(chǎn)品。